Mirin

Mirin inibisce l'attivazione di ATM indotta da DSB, la fosforilazione ATM-dipendente dei target a valle Nbs1 e Chk2 e l'autofosforilazione ATM-dipendente di ATM a Ser1981 in risposta ai DSB. Questo composto inibisce anche il checkpoint G2 nelle cellule TOSA4 e la riparazione del DNA dipendente dall'omologia nelle cellule HEK293. [1]

Nelle cellule con HPV16 integrato (SiHa), sensibilizza gli episomi di HPV a PA25, con una riduzione di circa 5 volte dell'IC50 di PA25. [2]

Il pretrattamento con questa sostanza chimica diminuisce anche la vitalità cellulare e inibisce l'espressione dell'antigene nucleare delle cellule proliferanti nelle cellule renali embrionali umane 293 trattate con cisplatino. [3]

Mirin in nanoparticelle ha comportato una forte compromissione della crescita tumorale, associata all'attivazione della DDR, all'accumulo di p53 e alla morte cellulare.

• Saggio di nucleasi

  Le reazioni con substrati oligonucleotidici non a forcina contengono 25 mM di MOPS (pH 7.0), 60 mM di KCl, 0.2% di Tween 20, 2 mM di DTT, 1 mM o 5 di MnCl₂ (o 5 mM di MgCl₂, o 5 mM di CaCl₂), 0.1 pmol di substrato di DNA e 0.3 pmol di Mre11 (o una quantità equivalente di Mre11 complessato con Rad50) in un volume di 10 μl, e vengono incubate a 37°C per 30 min. SDS, EDTA e proteinasi K vengono quindi aggiunti a concentrazioni finali di 0.2%, 5 mM e 0.1 mg/ml, rispettivamente, e incubati per altri 15 min. 4 μl di ciascuna reazione vengono miscelati con 4 μl di tampone di caricamento in formammide, e quindi caricati su un gel di sequenziamento contenente 10% di acrilammide e 7 M di urea. Dopo la corsa, ogni gel viene analizzato utilizzando un sistema di fosfoimmagini. Le reazioni contenenti substrati a forcina sono identiche a quelle con substrati non a forcina, tranne che 3 pmol di questo composto vengono aggiunti alle reazioni come indicato, e le reazioni vengono incubate a temperatura ambiente per tutta la notte. Le reazioni di giunzione di estremità non omologhe contengono 25 mM di MOPS (pH 7.0), 60 mM di KCl, 0.2% di Tween 20, 2 mM di DTT, 4 mM di MgCl₂, 2 mM di MnCl₂, 0.5 mM di ATP, 4 ng di DNA plasmidico, 10% di polietilenglicole, 0.01 pmol di DNA ligasi I umana e 0.06 pmol di questa sostanza chimica o 0.1 unità di esonucleasi III di E. coli (GIBCO-BRL), in un volume di 10 μl. Dopo l'incubazione a 37°C per 25 min, il Tween 20 viene aggiunto a una concentrazione finale dello 0.5%, e un'aliquota di 2.5 μl viene amplificata mediante PCR utilizzando i primer DAR5 e DAR147. I prodotti della PCR vengono clonati utilizzando il kit di clonazione TA e sequenziati utilizzando un analizzatore genetico capillare ABI automatizzato.

• Linee cellulari

  HEK 293 cells

• Concentrazioni

  100 μM

• Tempo di incubazione

  24 h

• Metodo

  Human embryonic kidney (HEK) 293 cells are maintained in RPMI-1640 supplemented with 5% heat-inactivated fetal bovine serum, penicillin (100 U/mL), and streptomycin (100 mg/mL) in humidified air with 5% CO₂ at 37 °C. Cells are given fresh medium at 48 h intervals. The cells are seeded in 96-well plates in regular growth medium. Cells are pretreated with mirin (100 μM for 1 h before the cisplatin (20 μM) treatment followed by incubation for 8 and 24 h. The MTT assay is performed using the EZ-Cytox cell viability assay kit according to the manufacturer's protocol and MTT reduction is measured at a 450 nm wavelength using a micro-plate reader.