JIB-04

Il JMJD2E attivo aa 1-350 viene purificato da E. coli e utilizzato in vitro in presenza di α-chetoglutarato, 5-10 μM di ferro, acido ascorbico e un substrato peptidico istonico in una reazione accoppiata con formaldeide deidrogenasi supplementata con NAD+ per quantificare la produzione di NADH o utilizzando il kit Epigentek P-3081. Per le reazioni di demetilazione istonica quantificate mediante analisi Western, un costrutto di espressione di hJMJ2D aa 1-350 con tag His, gentilmente donato dai Dott. Y. Shi e J. Whetstine, viene espresso e purificato da E. coli seguendo le istruzioni del manuale di agarosio Ni-NTA Qiagen e il protocollo di Whestine et al 54. In breve, la proteina viene eluita in 50 mM TrisHCl pH 7,8 + 0,3 M NaCl + 10% Glicerolo + 200 mM immidazolo, e dializzata contro 20 mM TrisHCl pH 7,4, 0,15 M NaCl, 0,2 mM PMSF, 0,5 mM DTT, 8% glicerolo. L'enzima viene alíquidato, congelato rapidamente e conservato a -80°C. Per i saggi di attività tramite Western blot, circa 1,5 μg di enzima vengono combinati con 0,3 μg di substrato H3K9me3 (Active Motif #31213) in 10 μM (NH₄)₂Fe(SO₄)₂, 1 mM α-chetoglutarato e 2 mM L-ascorbato di sodio in 50 mM Hepes pH 7,9 in presenza di veicolo o farmaco e incubati per 30 min-2 ore a 37°C. Il tampone di caricamento SDS viene aggiunto alle reazioni e, dopo ebollizione, i campioni vengono caricati su gel NuPage 4-12% Bis-Tris, trasferiti su nitrocellulosa e blotati utilizzando Upstate #07-523 per rilevare H3K9me3. Per la rilevazione del segnale totale H3, utilizziamo Active Motif #39763 (primario) e IgG anti-coniglio di asino coniugato con IRDye 680 (secondario, LI-COR # 926-32223) e le membrane vengono immaginate in un sistema di imaging a infrarossi Odyssey gentilmente messo a disposizione dal Dr. M. Cobb. Per le determinazioni di IC50 in vitro e gli studi di competizione, tipicamente 100-200 ng di proteina purificata vengono incubati con veicolo, JIB-04 o analoghi, come indicato nelle didascalie delle figure, e l'attività viene misurata mediante ELISA (kit Epigentek P-3081 per la demetilazione di H3K9me3, P-3083 per la demetilazione di H3K4me3 e P-3085 per la demetilazione di H3K27me3) in reazioni contenenti 50 mM Hepes pH 7,5, 0,01% Tween 20, 120 nM (NH₄)₂Fe(SO₄)₂, 1 mM α-chetoglutarato, 2 mM L-ascorbato di sodio e 50 ng di substrato peptidico. Le concentrazioni finali di enzima nelle reazioni erano le seguenti: 206 nM JMJD2A, 12 nM JMJD2B, 60 nM JMJD2C, 90 nM JMJD2D E.coli, 30 nM JMJD2D Sf9, 30 nM JMJD2E, 30 nM Jarid1a, 35 nM JMJD3. Le letture di fondo sono fornite da enzimi inattivati dal calore, 0,5-1 mM 2,4 PDCA o reazioni senza 2-OG. hJMJD2A (aa1-350) purificato in E. coli è un gentile dono del Dr. Jose Rizo-Rey ed è saggiato a 400 ng/reazione a causa della sua intrinseca bassa attività. Il software GraphPad Prism viene utilizzato per i calcoli di IC50 e l'adattamento delle curve. JMJD2D di E. coli purificato da noi e JMJD2D di Sf9 di BPS hanno dato risultati indistinguibili. Si noti che per i saggi di competizione del substrato, al fine di rimanere nell'intervallo lineare del saggio e non saturare la capacità di legame della piastra ELISA, le reazioni con > 0,75 μM H3K9me3 contengono substrato non biotinilato o vengono diluite nella fase di rilevamento e i segnali vengono regolati per fattore di diluizione. Per la quantificazione diretta dell'attività demetilasica di H3K9me3 in lisati cellulari, cellule trattate (piastrate a 2 milioni/piatto da 10 cm) o omogenati tumorali in PBS sono stati sonicati (3x 4 sec) e quantità uguali di proteina vengono incubate con un substrato di istone H3K9me3 in un tampone di reazione contenente cofattori per 2 ore a 37°C prima di una specifica immunorilevazione del prodotto H3K9me2 utilizzando i reagenti del kit Epigentek P-3081. 500 ng di proteina PHD2 purificata da E. coli in 40 mM Tris pH 7,4, 100 mM NaCl, 20% glicerolo, 5 mM β-mercapto-etanolo, 10 mM maltosio vengono utilizzati per ottenere attività nell'intervallo lineare. Peptidi biotinilati derivati da HIF-1 ODD (Biotin-Acp-DLDLEALAPYIPADDDFQL o Biotin-Acp-DLDLEALAP(OH)YIPADDDFQL come controllo idrossilato) sono immobilizzati su piastre a 96 pozzetti rivestite di Neutravidina. L'enzima viene incubato nei pozzetti rivestiti in tampone di reazione (20 mM Tris-Cl pH 7,5, 5 mM KCl, 1,5 mM MgCl₂, 2 mM DTT, 0,12 μM solfato ferroso, 0,5 mM 2-ossoglutarato e 1 mM ascorbato) per 45 min a temperatura ambiente in presenza dei farmaci indicati. L'analogo competitivo di α-chetoglutarato, DMOG, viene utilizzato come controllo positivo per l'inibizione. L'idrossilazione peptidica viene rilevata utilizzando un anticorpo policlonale di coniglio prodotto contro un epitopo peptidico di HIF idrossilato (anticorpo anti-idrossiprolina 4817 di produzione interna), seguito dall'aggiunta di un anticorpo secondario di capra anti-coniglio coniugato con HRP. La luminescenza viene misurata in un lettore di piastre EnVision. L'attività della proteina ricombinante LSD1 viene misurata utilizzando il kit Epigentek P-3075 secondo il protocollo del produttore con l'inibitore proprietario.

Human lung cancer cell lines (LCa), primary or immortalized non-tumorigenic HBECs, prostate cancer (PCa), primary prostate stromal (PrSC) and prostate epithelial cells (PrEC).

~10 μM

96 hours

For cell viability assays, cells are plated at 1500-3000 cells/well in 96 well plates and treated the next day with increasing doses of this compound over 4 days and their viability assessed by standard MTS assays using Promega’s Cell Titer or Cell Titer-Glo reagents according to the manufacturer’s protocols. Absorbance at 490 nm and 650 nm or luminescence is measured by a Spectra Max or a FlouroStar Omega plate reader. Data are normalized to the untreated controls (100% viability). Each cell line is tested in 2-5 independent assays, each containing 4-8 replicates. IC50 values are calculated using DIVISA, a high-throughput software, developed in hous, for storing and analyzing drug sensitivity assays. Dose-response curves are plotted using a non-linear regression model and IC50s are determined from the fitted curves. The average IC50 derived from 2-5 independent assays, each containing 4-8 replicates is reported.

Mice harboring H358 xenografts or A549 xenografts

110 mg/kg (H358, i.p.), 55 mg/kg (A549, Oral gavage)

Oral gavage or i.p.