IOX1

IOX1 aumenta i livelli di H3K9me3 nelle cellule HeLa tramite l'inibizione di KDM4A senza effetti significativi sulla vitalità cellulare. Questo composto mostra una minore efficacia nelle cellule HeLa a causa della bassa permeabilità cellulare, mentre il derivato n-ottil estere ne migliora la permeabilità cellulare. [1]

• Saggio AlphaScreen

  Tutti i reagenti vengono diluiti in 50 mM HEPES, 0,1% BSA, pH 7,5 supplementato con 0,01% Tween20 e lasciati equilibrare a temperatura ambiente prima dell'aggiunta alle piastre. I saggi di turnover catalitico vengono eseguiti in volumi di 10 μL in piastre a 384 pozzetti a basso volume a TA. La reazione consisteva in enzima (5 nM), peptide substrato biotinilato (30 nM), Fe(II) (1 μM), ascorbato (100 μM), 2OG (10 μM) ed è stata eseguita a TA. Per PHD2, la reazione consisteva in enzima (5 nM), peptide substrato biotinilato (60 nM), Fe(II) (20 μM), ascorbato (200 μM), 2OG (2 μM) ed è stata eseguita a TA. L'EDTA viene utilizzato per bloccare la reazione (5 μL), vengono aggiunte perle donatrici (coniugate con streptavidina) e accettrici (coniugate con proteina A) AlphaScreen preincubate con anticorpi del prodotto peptidico (5 μL). Le piastre vengono sigillate con pellicola per proteggerle dalla luce, incubate a temperatura ambiente per 60 minuti e lette su un lettore di piastre PHERAstar FS utilizzando un set di filtri AlphaScreen 680 eccitazione/570 emissione. La concentrazione finale delle perle nella reazione di 20 μL è di 20 μg/mL. I valori di IC50 vengono calcolati in Prism 6 dopo la normalizzazione rispetto ai controlli DMSO corrispondenti.

• Linee cellulari

  HeLa cells

• Concentrazioni

  ~300 μ M

• Tempo di incubazione

  24 hours

• Metodo

  Antiproliferative activities of compounds are determined by the MTT assay. HeLa cells are seeded into 96-well plates and cultured at 37 °C for 24 h to achieve 70%. Subsequently, the medium is replaced with DMEM medium containing the tested compounds in different concentrations of 1-300 μM in 1% DMSO. Staurosporine in 0.03-10 μM final concentration is used as a control for cytotoxicity. After 24 h of treatment, the medium is replaced with CellTiter 96 Aqueous One Solution Reagent and incubated for 4 hours. CC50 values are calculated in Prism 6 software after normalisation against corresponding 1% DMSO treated cells and 1% DMSO in media (no cells) controls.