Scheda tecnica

Descrizione biologica

Specificità	Integrin β 3 Antibody [P12C15] riconosce i livelli endogeni della proteina totale Integrin β 3.
Contesto	L'Integrin β3 è una subunità chiave della famiglia di recettori transmembrana Integrin che mediano l'adesione cellulare alla matrice extracellulare (ECM) e trasducono segnali bidirezionalmente attraverso la membrana plasmatica. Si accoppia comunemente con le subunità αV o αIIb per formare le integrine αVβ3 e αIIbβ3, che svolgono ruoli essenziali in diversi processi biologici come l'aggregazione piastrinica (αIIbβ3), l'angiogenesi, la migrazione cellulare e la sopravvivenza (αVβ3). L'Integrin β3 presenta un ampio dominio extracellulare, che include il dominio βA (simile a I) responsabile del legame del ligando, un dominio ibrido, un dominio plexin-semaforina-Integrin (PSI) e più domini I-EGF, seguiti da una singola regione transmembrana e una breve coda citoplasmatica che interagisce con le proteine intracellulari. Il dominio transmembrana è critico per l'eterodimerizzazione α/β e la trasmissione del segnale. Nel suo stato inattivo, l'integrina β3 adotta una conformazione piegata, ma al momento dell'attivazione, subisce drammatici cambiamenti conformazionali, estensione a livello del "ginocchio" I-EGF1/2 e rotazione del dominio ibrido, consentendo un legame del ligando ad alta affinità e la separazione delle "gambe". L'attivazione è strettamente regolata dalla segnalazione "inside-out", dove proteine come la talina e la kindlina si legano alla coda citoplasmatica, innescando cambiamenti conformazionali da stati a bassa ad alta affinità. La segnalazione "outside-in" segue l'engagement del ligando, portando al riarrangiamento citoscheletrico e alla modulazione dell'espressione genica. L'integrina β3 contribuisce anche al riassorbimento osseo da parte degli osteoclasti, al traffico delle cellule immunitarie e alla progressione tumorale. La sua attività è modulata da cationi bivalenti (Ca²⁺, Mg²⁺, Mn²⁺), fosforilazione di residui citoplasmatici e interazioni con altre proteine di membrana. Varianti genetiche, come il polimorfismo Leu33Pro nel dominio PSI, sono associate a risposte immunitarie alterate e ad un aumentato rischio di trombosi. La disregolazione dell'integrina β3 è implicata nella trombosi, nelle metastasi tumorali e nelle malattie infiammatorie.

Specificità

Integrin β 3 Antibody [P12C15] riconosce i livelli endogeni della proteina totale Integrin β 3.

Contesto

L'Integrin β3 è una subunità chiave della famiglia di recettori transmembrana Integrin che mediano l'adesione cellulare alla matrice extracellulare (ECM) e trasducono segnali bidirezionalmente attraverso la membrana plasmatica. Si accoppia comunemente con le subunità αV o αIIb per formare le integrine αVβ3 e αIIbβ3, che svolgono ruoli essenziali in diversi processi biologici come l'aggregazione piastrinica (αIIbβ3), l'angiogenesi, la migrazione cellulare e la sopravvivenza (αVβ3). L'Integrin β3 presenta un ampio dominio extracellulare, che include il dominio βA (simile a I) responsabile del legame del ligando, un dominio ibrido, un dominio plexin-semaforina-Integrin (PSI) e più domini I-EGF, seguiti da una singola regione transmembrana e una breve coda citoplasmatica che interagisce con le proteine intracellulari. Il dominio transmembrana è critico per l'eterodimerizzazione α/β e la trasmissione del segnale. Nel suo stato inattivo, l'integrina β3 adotta una conformazione piegata, ma al momento dell'attivazione, subisce drammatici cambiamenti conformazionali, estensione a livello del "ginocchio" I-EGF1/2 e rotazione del dominio ibrido, consentendo un legame del ligando ad alta affinità e la separazione delle "gambe". L'attivazione è strettamente regolata dalla segnalazione "inside-out", dove proteine come la talina e la kindlina si legano alla coda citoplasmatica, innescando cambiamenti conformazionali da stati a bassa ad alta affinità. La segnalazione "outside-in" segue l'engagement del ligando, portando al riarrangiamento citoscheletrico e alla modulazione dell'espressione genica. L'integrina β3 contribuisce anche al riassorbimento osseo da parte degli osteoclasti, al traffico delle cellule immunitarie e alla progressione tumorale. La sua attività è modulata da cationi bivalenti (Ca²⁺, Mg²⁺, Mn²⁺), fosforilazione di residui citoplasmatici e interazioni con altre proteine di membrana. Varianti genetiche, come il polimorfismo Leu33Pro nel dominio PSI, sono associate a risposte immunitarie alterate e ad un aumentato rischio di trombosi. La disregolazione dell'integrina β3 è implicata nella trombosi, nelle metastasi tumorali e nelle malattie infiammatorie.

Informazioni sullutilizzo

Applicazione

WB, IP, FCM

Diluizione

WB	IP	FCM
1:1000	1:20	1:20

Reattività

Human, Mouse, Rat

Fonte

Rabbit Monoclonal Antibody

MW

87 kDa

Tampone di conservazione

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

Conservazione
(Dalla data di ricevimento)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

Metodi sperimentali
WB	Experimental Protocol: Sample preparation 1. Tissue: Lyse the tissue sample by adding an appropriate volume of ice-cold RIPA/NP-40 Lysis Buffer (containing Protease Inhibitor Cocktail)，and homogenize the tissue at a low temperature. 2. Adherent cell: Aspirate the culture medium and wash the cells with ice-cold PBS twice. Lyse the cells by adding an appropriate volume of RIPA/NP-40 Lysis Buffer (containing Protease Inhibitor Cocktail) and put the sample on ice for 5 min. 3. Suspension cell: Transfer the culture medium to a pre-cooled centrifuge tube. Centrifuge and aspirate the supernatant. Wash the cells with ice-cold PBS twice. Lyse the cells by adding an appropriate volume of RIPA/NP-40 Lysis Buffer (containing Protease Inhibitor Cocktail) and put the sample on ice for 5 min. 4. Place the lysate into a pre-cooled microcentrifuge tube. Centrifuge at 4°C for 15 min. Collect the supernatant; 5. Remove a small volume of lysate to determine the protein concentration; 6. Combine the lysate with protein loading buffer. Boil 20 µL sample under 95-100°C for 5 min. Centrifuge for 5 min after cool down on ice. Electrophoretic separation 1. According to the concentration of extracted protein, load appropriate amount of protein sample and marker onto SDS-PAGE gels for electrophoresis. Recommended separating gel (lower gel) concentration: 10%. Reference Table for Selecting SDS-PAGE Separation Gel Concentrations 2. Power up 80V for 30 minutes. Then the power supply is adjusted (110 V~150 V), the Marker is observed, and the electrophoresis can be stopped when the indicator band of the predyed protein Marker where the protein is located is properly separated. (Note that the current should not be too large when electrophoresis, too large current (more than 150 mA) will cause the temperature to rise, affecting the result of running glue. If high currents cannot be avoided, an ice bath can be used to cool the bath.) Transfer membrane 1. Take out the converter, soak the clip and consumables in the pre-cooled converter; 2. Activate PVDF membrane with methanol for 1 min and rinse with transfer buffer; 3. Install it in the order of "black edge of clip - sponge - filter paper - filter paper - glue -PVDF membrane - filter paper - filter paper - sponge - white edge of clip"; 4. The protein was electrotransferred to PVDF membrane. ( 0.45 µm PVDF membrane is recommended ) Reference Table for Selecting PVDF Membrane Pore Size Specifications Recommended conditions for wet transfer: 200 mA, 120 min. ( Note that the transfer conditions can be adjusted according to the protein size. For high-molecular-weight proteins, a higher current and longer transfer time are recommended. However, ensure that the transfer tank remains at a low temperature to prevent gel melting.) Block 1. After electrotransfer, wash the film with TBST at room temperature for 5 minutes; 2. Incubate the film in the blocking solution for 1 hour at room temperature; 3. Wash the film with TBST for 3 times, 5 minutes each time. Antibody incubation 1. Use 5% skim milk powder to prepare the primary antibody working liquid (recommended dilution ratio for primary antibody 1:1000), gently shake and incubate with the film at 4°C overnight; 2. Wash the film with TBST 3 times, 5 minutes each time; 3. Add the secondary antibody to the blocking solution and incubate with the film gently at room temperature for 1 hour; 4. After incubation, wash the film with TBST 3 times for 5 minutes each time. Antibody staining 1. Add the prepared ECL luminescent substrate (or select other color developing substrate according to the second antibody) and mix evenly; 2. Incubate with the film for 1 minute, remove excess substrate (keep the film moist), wrap with plastic film, and expose in the imaging system.

Metodi sperimentali

WB

Experimental Protocol:

Sample preparation

1. Tissue: Lyse the tissue sample by adding an appropriate volume of ice-cold RIPA/NP-40 Lysis Buffer (containing Protease Inhibitor Cocktail)，and homogenize the tissue at a low temperature.

2. Adherent cell: Aspirate the culture medium and wash the cells with ice-cold PBS twice. Lyse the cells by adding an appropriate volume of RIPA/NP-40 Lysis Buffer (containing Protease Inhibitor Cocktail) and put the sample on ice for 5 min.

3. Suspension cell: Transfer the culture medium to a pre-cooled centrifuge tube. Centrifuge and aspirate the supernatant. Wash the cells with ice-cold PBS twice. Lyse the cells by adding an appropriate volume of RIPA/NP-40 Lysis Buffer (containing Protease Inhibitor Cocktail) and put the sample on ice for 5 min.

4. Place the lysate into a pre-cooled microcentrifuge tube. Centrifuge at 4°C for 15 min. Collect the supernatant;

5. Remove a small volume of lysate to determine the protein concentration;

6. Combine the lysate with protein loading buffer. Boil 20 µL sample under 95-100°C for 5 min. Centrifuge for 5 min after cool down on ice.

Electrophoretic separation

1. According to the concentration of extracted protein, load appropriate amount of protein sample and marker onto SDS-PAGE gels for electrophoresis. Recommended separating gel (lower gel) concentration: 10%. Reference Table for Selecting SDS-PAGE Separation Gel Concentrations

2. Power up 80V for 30 minutes. Then the power supply is adjusted (110 V~150 V), the Marker is observed, and the electrophoresis can be stopped when the indicator band of the predyed protein Marker where the protein is located is properly separated. (Note that the current should not be too large when electrophoresis, too large current (more than 150 mA) will cause the temperature to rise, affecting the result of running glue. If high currents cannot be avoided, an ice bath can be used to cool the bath.)

Transfer membrane

1. Take out the converter, soak the clip and consumables in the pre-cooled converter;

2. Activate PVDF membrane with methanol for 1 min and rinse with transfer buffer;

3. Install it in the order of "black edge of clip - sponge - filter paper - filter paper - glue -PVDF membrane - filter paper - filter paper - sponge - white edge of clip";

4. The protein was electrotransferred to PVDF membrane. ( 0.45 µm PVDF membrane is recommended ) Reference Table for Selecting PVDF Membrane Pore Size Specifications

Recommended conditions for wet transfer: 200 mA, 120 min.

( Note that the transfer conditions can be adjusted according to the protein size. For high-molecular-weight proteins, a higher current and longer transfer time are recommended. However, ensure that the transfer tank remains at a low temperature to prevent gel melting.)

Block

1. After electrotransfer, wash the film with TBST at room temperature for 5 minutes;

2. Incubate the film in the blocking solution for 1 hour at room temperature;

3. Wash the film with TBST for 3 times, 5 minutes each time.

Antibody incubation

1. Use 5% skim milk powder to prepare the primary antibody working liquid (recommended dilution ratio for primary antibody 1:1000), gently shake and incubate with the film at 4°C overnight;

2. Wash the film with TBST 3 times, 5 minutes each time;

3. Add the secondary antibody to the blocking solution and incubate with the film gently at room temperature for 1 hour;

4. After incubation, wash the film with TBST 3 times for 5 minutes each time.

Antibody staining

1. Add the prepared ECL luminescent substrate (or select other color developing substrate according to the second antibody) and mix evenly;

2. Incubate with the film for 1 minute, remove excess substrate (keep the film moist), wrap with plastic film, and expose in the imaging system.

Riferimenti

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30018079/
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/19704023/

Dati di applicazione

WB

Validato da Selleck

Lane 1: U-87MG, Lane 2: HEL, Lane 3: HUVEC, Lane 4: C2C12