CAL-101 (Idelalisib)

Idelalisib (CAL-101) non è sensibile ad altre subunità di PI3K di classe I, incluse p110α, p110β e p110γ. Blocca specificamente l'espressione di CD63 mediata da FcϵR1 p110δ con una EC50 di 8 nM nei basofili primari. Questo composto mostra una maggiore attività nelle cellule di leucemia linfoblastica acuta a cellule B (B-ALL) e leucemia linfatica cronica (CLL) rispetto alle cellule di leucemia mieloide acuta (AML) e neoplasia mieloproliferativa (MPN). Produce la riduzione di pAktS473, pAktT308 e del bersaglio a valle S6 nelle cellule SU-DHL-5, KARPAS-422 e CCRF-SB con una EC50 da 0,1 a 1,0 μM. [1]

Induce citotossicità selettiva nelle cellule di CLL indipendentemente dallo stato mutazionale di IgVH o dalla citogenetica interfase, principalmente attraverso un meccanismo dipendente dalle caspasi. Il composto induce citotossicità preferenzialmente nelle cellule di CLL rispetto ai linfociti B normali, senza produrre citotossicità in altre cellule ematopoietiche, rispetto a LY294002. Manca di potenziale citotossico diretto nei confronti delle cellule T e delle cellule natural killer (NK). Può inibire la produzione di citochine infiammatorie, come IL-6, IL-10, TNF-α e IFN-γ, e citochine indotte dall'attivazione, come CD40L. Antagonizza anche la sopravvivenza delle cellule di CLL mediata da CD40L. [2]

Induce un accumulo di cellule in G1 e una diminuzione della popolazione in fase S nelle cellule L1236 e L591, il che indica questo composto come una nuova strategia per il trattamento del linfoma di Hodgkin (HL). [3]

• Saggio PI3K

  Il saggio PI3K viene eseguito su lisati di cellule intere da cellule CLL o linfociti B normali. Viene eseguito un saggio ELISA PI3K. In breve, gli estratti di cellule intere vengono aggiunti a una miscela di substrato PI(4,5)P2 e tampone di reazione contenente adenosina trifosfato (ATP) e lasciati incubare a temperatura ambiente. La reazione viene interrotta aggiungendo il rivelatore PI(3,4,5)P3 miscelato con EDTA (acido etilendiamminotetraacetico) e lasciato incubare a temperatura ambiente per 1 ora. Trascorso questo tempo, la miscela viene trasferita da ciascun pozzetto a una piastra ELISA PI3K e lasciata incubare per 1 ora. Le piastre vengono lavate e quindi incubate con un rivelatore secondario per 30 minuti. Le piastre vengono lavate di nuovo e viene aggiunta una soluzione di 3,3′,5,5′-tetrametilbenzidina per 5 minuti, dopodiché viene aggiunto H2SO4 per interrompere tutte le reazioni. Le piastre vengono lette a 450 nm su un lettore di piastre a 96 pozzetti Labsystems.

• Linee cellulari

  CLL B cells or healthy volunteer T cells or NK cells

• Concentrazioni

  0.01-100 μM

• Tempo di incubazione

  48 hours

• Metodo

  MTT assays are performed to determine cytotoxicity. 1 × 10⁵ cells are incubated with Idelalisib (CAL-101). MTT reagent is then added, and plates are incubated for an additional 20 hours before washing in phosphate-buffered saline. DMSO is added, and absorbance is measured by spectrophotometry at 540 nm in a Labsystems plate reader. Cell viability is also measured at various time points with the use of annexin/PI flow cytometry. Data are analyzed. At least 104 cells are counted for each sample. Results are expressed as the percentage of total positive cells over untreated control. Experiments examining caspase-dependent apoptosis included the addition of 100 μM Z-VAD. Experiments examining survival signals include the addition of 1 μg/mL CD40L, 800 U/mL IL-4, 50 ng/mL BAFF, 20 ng/mL TNF-α, or coculturing on fibronectin or stromal (HS-5 cell line) coated plates. Stromal coculture is done by plating a 75-cm² flask (80%-100% confluent) per 6-well plate 24 hours before the addition of CLL cells.