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Descrizione biologica
| Specificità | Human Dectin-1/CLEC7A Antibody [J4K7] rileva i livelli endogeni della proteina Dectin-1/CLEC7A totale. |
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| Contesto | La Dectina-1 umana (CLEC7A) è un recettore transmembrana di tipo II a lectina di tipo C (CLR) prevalentemente espresso sulle cellule mieloidi, inclusi monociti, macrofagi, cellule dendritiche e neutrofili, e serve come principale recettore di riconoscimento di pattern per i β-glucani fungini nell'immunità innata. Comprende un singolo dominio di riconoscimento dei carboidrati (CRD) extracellulare privo di uno stelo nell'isoforma corta, con una scanalatura di legame superficiale, esposta al solvente, formata dai residui W221, N242 ed E248 che ospita polimeri di β-1,3/β-1,6-glucano dalle pareti cellulari di lieviti e micobatteri attraverso interazioni Ca²⁺-indipendenti, simili a lectine, supportate da impilamento idrofobico e legami idrogeno. Il recettore contiene una singola elica transmembrana e una breve coda citoplasmatica che porta un motivo hemITAM non convenzionale (E²YSEI) invece dei classici motivi ITAM o ITIM. In seguito all'ingaggio del ligando, la Dectina-1 si raggruppa all'interno di nanodomini di membrana ricchi di colesterolo, consentendo il reclutamento di chinasi della famiglia Src (SFK) per fosforilare la tirosina hemITAM, che a sua volta recluta la chinasi Syk tramite i suoi doppi domini SH2. Ciò porta all'aggancio del complesso CARD9/Bcl10/MALT1 e alla successiva attivazione di NF-κB p65, promuovendo la produzione di citochine proinfiammatorie come IL-12, IL-23, IL-6 e TNF-α. La co-localizzazione con TLR2 potenzia sinergicamente la segnalazione MAPK (p38, ERK, JNK) e la generazione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) tramite NOX2. L'isoforma più lunga della Dectina-1, che include una regione dello stelo, consente la fagocitosi dello zimosano facilitando la multivalenza del CRD e un efficace inglobamento fungino. Questo asse di segnalazione Syk–CARD9–NF-κB orda l'immunità mediata da Th17 contro patogeni come Candida e Aspergillus, mentre l'O-glicosilazione (T105 sialil-core1) della regione dello stelo agisce paradossalmente come un contro-ligando per la CLEC-2 piastrinica, sopprimendo così la trombosi durante l'infezione. |
Informazioni sullutilizzo
| Applicazione | IF, FCM | Diluizione |
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| Reattività | Human | ||||||
| Fonte | Mouse Monoclonal Antibody | MW | |||||
| Tampone di conservazione | PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 | Conservazione (Dalla data di ricevimento) |
-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years | ||||
| IF |
Experimental Protocol:
Sample Preparation
1. Adherent Cells: Place a clean, sterile coverslip in a culture dish. Once the cells grow to near confluence as a monolayer, remove the coverslip for further use.
2. Suspension Cells: Seed the cells onto a clean, sterile slide coated with poly-L-lysine.
3. Frozen Sections: Allow the slide to thaw at room temperature. Wash it with pure water or PBS for 2 times, 3 minutes each time.
4. Paraffin Sections: Deparaffinization and rehydration. Wash the slide with pure water or PBS for 3 times, 3 minutes each time. Then perform antigen retrieval.
Fixation
1. Fix the cell coverslips/spots or tissue sections at room temperature using a fixative such as 4% paraformaldehyde (4% PFA) for 10-15 minutes.
2. Wash the sample with PBS for 3 times, 3 minutes each time.
Permeabilization
1.Add a detergent such as 0.1–0.3% Triton X-100 to the sample and incubate at room temperature for 10–20 minutes.
(Note: This step is only required for intracellular antigens. For antigens expressed on the cell membrane, this step is unnecessary.)
Wash the sample with PBS for 3 times, 3 minutes each time.
Blocking
Add blocking solution and incubate at room temperature for at least 1 hour. (Common blocking solutions include: serum from the same source as the secondary antibody, BSA, or goat serum.)
Note: Ensure the sample remains moist during and after the blocking step to prevent drying, which can lead to high background.
Immunofluorescence Staining (Day 1)
1. Remove the blocking solution and add the diluted primary antibody.
2. Incubate the sample in a humidified chamber at 4°C overnight.
Immunofluorescence Staining (Day 2)
1. Remove the primary antibody and wash with PBST for 3 times, 5 minutes each time.
2. Add the diluted fluorescent secondary antibody and incubate in the dark at 4°C for 1–2 hours.
3. Remove the secondary antibody and wash with PBST for 3 times, 5 minutes each time.
4. Add diluted DAPI and incubate at room temperature in the dark for 5–10 minutes.
5. Wash with PBST for 3 times, 5 minutes each time.
Mounting
1. Mount the sample with an anti-fade mounting medium.
2. Allow the slide to dry at room temperature overnight in the dark.
3. Store the slide in a slide storage box at 4°C, protected from light.
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Riferimenti
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