Scheda tecnica

Descrizione biologica

Specificità	Histone H4 (tri methyl Lys20) Antibody [J13H2] riconosce i livelli endogeni della proteina istonica H4 solo quando trimetilata in Lys20. Questo anticorpo non presenta reattività crociata con l'istone H4 Lys20 non metilata, monometilata o dimetilata. Questo anticorpo rileva una proteina non specifica di 95 kDa di origine sconosciuta.
Contesto	La Tri-Metil-Istona H4 (Lys20), anche nota come H4K20me3, è una specifica modificazione post-traduzionale istonica cruciale per il mantenimento dell'integrità genomica e la regolazione della struttura della cromatina. La metilazione della lisina 20 dell'istone H4 esiste in tre stati: monometilazione (H4K20me1), dimetilazione (H4K20me2) e trimetilazione (H4K20me3), con H4K20me3 che è il marchio di trimetilazione sul residuo di lisina 20 dell'istone H4. Questa modificazione è conservata evolutivamente dal lievito agli esseri umani e serve come marcatore per l'eterocromatina trascrizionalmente silente, indicando regioni del genoma che non sono attivamente trascritte. H4K20me3 è altamente arricchita in specifiche posizioni genomiche come l'eterocromatina pericentrica, i telomeri, le regioni imprintate e gli elementi ripetitivi, giocando un ruolo nel mantenere queste aree in uno stato represso. È essenziale per l'integrità genomica sia in assenza che in presenza di stress genotossico, formando parte della più ampia rete di risposta al danno del DNA (DDR). Gli enzimi SUV4-20H1 e SUV4-20H2 mediano principalmente la trimetilazione di H4K20. I diversi stati di metilazione di H4K20 cambiano dinamicamente durante il ciclo cellulare. H4K20me3 rimane più stabile e mostra cambiamenti meno drammatici rispetto a H4K20me1. H4K20me3 migliora il ripiegamento della cromatina e svolge un ruolo strutturale nell'impalcatura della cromatina. Una corretta regolazione della metilazione di H4K20 è vitale per mantenere la struttura e la funzione della cromatina, poiché le interruzioni in questa regolazione portano a instabilità genomica e altre disfunzioni cellulari.

Specificità

Histone H4 (tri methyl Lys20) Antibody [J13H2] riconosce i livelli endogeni della proteina istonica H4 solo quando trimetilata in Lys20. Questo anticorpo non presenta reattività crociata con l'istone H4 Lys20 non metilata, monometilata o dimetilata. Questo anticorpo rileva una proteina non specifica di 95 kDa di origine sconosciuta.

Contesto

La Tri-Metil-Istona H4 (Lys20), anche nota come H4K20me3, è una specifica modificazione post-traduzionale istonica cruciale per il mantenimento dell'integrità genomica e la regolazione della struttura della cromatina. La metilazione della lisina 20 dell'istone H4 esiste in tre stati: monometilazione (H4K20me1), dimetilazione (H4K20me2) e trimetilazione (H4K20me3), con H4K20me3 che è il marchio di trimetilazione sul residuo di lisina 20 dell'istone H4. Questa modificazione è conservata evolutivamente dal lievito agli esseri umani e serve come marcatore per l'eterocromatina trascrizionalmente silente, indicando regioni del genoma che non sono attivamente trascritte. H4K20me3 è altamente arricchita in specifiche posizioni genomiche come l'eterocromatina pericentrica, i telomeri, le regioni imprintate e gli elementi ripetitivi, giocando un ruolo nel mantenere queste aree in uno stato represso. È essenziale per l'integrità genomica sia in assenza che in presenza di stress genotossico, formando parte della più ampia rete di risposta al danno del DNA (DDR). Gli enzimi SUV4-20H1 e SUV4-20H2 mediano principalmente la trimetilazione di H4K20. I diversi stati di metilazione di H4K20 cambiano dinamicamente durante il ciclo cellulare. H4K20me3 rimane più stabile e mostra cambiamenti meno drammatici rispetto a H4K20me1. H4K20me3 migliora il ripiegamento della cromatina e svolge un ruolo strutturale nell'impalcatura della cromatina. Una corretta regolazione della metilazione di H4K20 è vitale per mantenere la struttura e la funzione della cromatina, poiché le interruzioni in questa regolazione portano a instabilità genomica e altre disfunzioni cellulari.

Informazioni sullutilizzo

Applicazione

WB, ChIP

Diluizione

WB	IP	CHIP
1:1000	1:50-1:200	1:50

Reattività

Human, Mouse, Rat, Monkey, Xenopus, Bovine, Pig

Fonte

Rabbit Monoclonal Antibody

MW

11 Kda

Tampone di conservazione

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN₃

Conservazione
(Dalla data di ricevimento)

–20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

Metodi sperimentali
WB	Experimental Protocol: Sample preparation 1. Tissue: Lyse the tissue sample by adding an appropriate volume of ice-cold RIPA/Nuclear Lysis Buffer (containing Protease Inhibitor Cocktail)，and homogenize the tissue at a low temperature or lyse it by sonication on ice, then incubate on ice for 30 minutes. 2. Adherent cell: Aspirate the culture medium and transfer the cells into an EP tube. Wash the cells with ice-cold PBS twice. Add an appropriate volume of RIPA/Nuclear Lysis Buffer (containing Protease Inhibitor Cocktail), sonicate to lyse the cells, and incubate on ice for 30 minutes. 3. Suspension cell: Transfer the culture medium to a pre-cooled centrifuge tube. Centrifuge and aspirate the supernatant. Wash the cells with ice-cold PBS twice.Add an appropriate volume of RIPA/Nuclear Lysis Buffer (containing Protease Inhibitor Cocktail), sonicate to lyse the cells, and incubate on ice for 30 minutes. 4. Place the lysate into a pre-cooled microcentrifuge tube. Centrifuge at 4°C for 15 min. Collect the supernatant; 5. Remove a small volume of lysate to determine the protein concentration; 6. Combine the lysate with protein loading buffer. Boil 20 µL sample under 95-100°C for 5 min. Centrifuge for 5 min after cool down on ice. Electrophoretic separation 1. According to the concentration of extracted protein, load appropriate amount of protein sample and marker onto SDS-PAGE gels for electrophoresis. Recommended separating gel (lower gel) concentration: 20%. Reference Table for Selecting SDS-PAGE Separation Gel Concentrations 2. Power up 80V for 30 minutes. Then the power supply is adjusted (110 V~150 V), the Marker is observed, and the electrophoresis can be stopped when the indicator band of the predyed protein Marker where the protein is located is properly separated. (Note that the current should not be too large when electrophoresis, too large current (more than 150 mA) will cause the temperature to rise, affecting the result of running glue. If high currents cannot be avoided, an ice bath can be used to cool the bath.) Transfer membrane 1. Take out the converter, soak the clip and consumables in the pre-cooled converter; 2. Activate PVDF membrane with methanol for 1 min and rinse with transfer buffer; 3. Install it in the order of "black edge of clip - sponge - filter paper - filter paper - glue -PVDF membrane - filter paper - filter paper - sponge - white edge of clip"; 4. The protein was electrotransferred to PVDF membrane. ( 0.22 µm PVDF membrane is recommended )） Reference Table for Selecting PVDF Membrane Pore Size Specifications Recommended conditions for wet transfer: 200 mA, 60 min. ( Note that the transfer conditions can be adjusted according to the protein size. For high-molecular-weight proteins, a higher current and longer transfer time are recommended. However, ensure that the transfer tank remains at a low temperature to prevent gel melting.) Block 1. After electrotransfer, wash the film with TBST at room temperature for 5 minutes; 2. Incubate the film in the blocking solution for 1 hour at room temperature; 3. Wash the film with TBST for 3 times, 5 minutes each time. Antibody incubation 1. Use 5% skim milk powder to prepare the primary antibody working liquid (recommended dilution ratio for primary antibody 1:1000), gently shake and incubate with the film at 4°C overnight; 2. Wash the film with TBST 3 times, 5 minutes each time; 3. Add the secondary antibody to the blocking solution and incubate with the film gently at room temperature for 1 hour; 4. After incubation, wash the film with TBST 3 times for 5 minutes each time. Antibody staining 575. Add the prepared ECL luminescent substrate (or select other color developing substrate according to the second antibody) and mix evenly; 2. Incubate with the film for 1 minute, remove excess substrate (keep the film moist), wrap with plastic film, and expose in the imaging system.

Metodi sperimentali

WB

Experimental Protocol:

Sample preparation

1. Tissue: Lyse the tissue sample by adding an appropriate volume of ice-cold RIPA/Nuclear Lysis Buffer (containing Protease Inhibitor Cocktail)，and homogenize the tissue at a low temperature or lyse it by sonication on ice, then incubate on ice for 30 minutes.

2. Adherent cell: Aspirate the culture medium and transfer the cells into an EP tube. Wash the cells with ice-cold PBS twice. Add an appropriate volume of RIPA/Nuclear Lysis Buffer (containing Protease Inhibitor Cocktail), sonicate to lyse the cells, and incubate on ice for 30 minutes.

3. Suspension cell: Transfer the culture medium to a pre-cooled centrifuge tube. Centrifuge and aspirate the supernatant. Wash the cells with ice-cold PBS twice.Add an appropriate volume of RIPA/Nuclear Lysis Buffer (containing Protease Inhibitor Cocktail), sonicate to lyse the cells, and incubate on ice for 30 minutes.

4. Place the lysate into a pre-cooled microcentrifuge tube. Centrifuge at 4°C for 15 min. Collect the supernatant;

5. Remove a small volume of lysate to determine the protein concentration;

6. Combine the lysate with protein loading buffer. Boil 20 µL sample under 95-100°C for 5 min. Centrifuge for 5 min after cool down on ice.

Electrophoretic separation

1. According to the concentration of extracted protein, load appropriate amount of protein sample and marker onto SDS-PAGE gels for electrophoresis. Recommended separating gel (lower gel) concentration: 20%. Reference Table for Selecting SDS-PAGE Separation Gel Concentrations

2. Power up 80V for 30 minutes. Then the power supply is adjusted (110 V~150 V), the Marker is observed, and the electrophoresis can be stopped when the indicator band of the predyed protein Marker where the protein is located is properly separated. (Note that the current should not be too large when electrophoresis, too large current (more than 150 mA) will cause the temperature to rise, affecting the result of running glue. If high currents cannot be avoided, an ice bath can be used to cool the bath.)

Transfer membrane

1. Take out the converter, soak the clip and consumables in the pre-cooled converter;

2. Activate PVDF membrane with methanol for 1 min and rinse with transfer buffer;

3. Install it in the order of "black edge of clip - sponge - filter paper - filter paper - glue -PVDF membrane - filter paper - filter paper - sponge - white edge of clip";

4. The protein was electrotransferred to PVDF membrane. ( 0.22 µm PVDF membrane is recommended )） Reference Table for Selecting PVDF Membrane Pore Size Specifications

Recommended conditions for wet transfer: 200 mA, 60 min.

( Note that the transfer conditions can be adjusted according to the protein size. For high-molecular-weight proteins, a higher current and longer transfer time are recommended. However, ensure that the transfer tank remains at a low temperature to prevent gel melting.)

Block

1. After electrotransfer, wash the film with TBST at room temperature for 5 minutes;

2. Incubate the film in the blocking solution for 1 hour at room temperature;

3. Wash the film with TBST for 3 times, 5 minutes each time.

Antibody incubation

1. Use 5% skim milk powder to prepare the primary antibody working liquid (recommended dilution ratio for primary antibody 1:1000), gently shake and incubate with the film at 4°C overnight;

2. Wash the film with TBST 3 times, 5 minutes each time;

3. Add the secondary antibody to the blocking solution and incubate with the film gently at room temperature for 1 hour;

4. After incubation, wash the film with TBST 3 times for 5 minutes each time.

Antibody staining

575. Add the prepared ECL luminescent substrate (or select other color developing substrate according to the second antibody) and mix evenly;

2. Incubate with the film for 1 minute, remove excess substrate (keep the film moist), wrap with plastic film, and expose in the imaging system.

Riferimenti

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/23345616/

Dati di applicazione

WB

Validato da Selleck

Lane 1: Hela
Lane 2: NIH3T3