GW843682X

GW 843682X è un inibitore submicromolare della proliferazione della maggior parte delle cellule tumorali in coltura, con una notevole eccezione rappresentata da PC-3, una linea cellulare di carcinoma prostatico. GW 843682X è anche selettivo per le cellule tumorali rispetto ai fibroblasti diploidi normali (HDF), con una differenza di potenza >10 volte. GW 843682X è equipotente (circa 200 nmol/L) contro MES-SA/DX5 e la linea parentale MES-SA, suggerendo che il composto non viene efficacemente rimosso dalla pompa di efflusso della P-glicoproteina nella cellula. GW 843682X inibisce in modo dose-dipendente la fosforilazione di Ser15-p53 da parte di PLK1 nelle cellule HeLa che esprimono la proteina chimerica p53-PLK1 inducibile da tet. GW 843682X migliora la crescita delle cellule HDF del 30% a 3,3 μM ed è in grado di migliorare la crescita di H460 alla concentrazione più bassa di 0,37 μM. GW 843682X provoca un forte arresto G2-M a 3 μM e un arresto G2-M molto scarso è osservato a 1 μM nelle cellule HDF. GW 843682X (3 μM) mostra un arresto G2-M ridotto, ma si osserva un aumento del contenuto di DNA sub-2N nelle cellule H460. GW 843682X (0,5 μM) produce cellule di dimensioni maggiori rispetto alle cellule H460 non trattate e con nuclei multipli. [1] GW 843682X inibisce PLK1, PLK2, PLK3 e PLK4 con valori di Ki di 4,8 nM, 3,8 nM, 8 nM e 0,163 μM, rispettivamente. [2] GW 843682X (1 μM) interferisce con la localizzazione di MyoGEF endogeno al fuso centrale nelle cellule HeLa. GW 843682X (1 μM) interrompe la localizzazione di GFP-MyoGEF-wt (GFP-WT), GFP-MyoGEF-T574A (GFP-T574A) e GFP-MyoGEF-T574E (GFP-T574E) al fuso centrale nelle cellule HeLa. [3] GW-843682X provoca un identico assemblaggio prematuro della zona mediana e il reclutamento di proteine, suggerendo che l'effetto del farmaco è specifico per l'inibizione di PLK1. GW 843682X (200 nM) provoca l'aggregazione dei microtubuli e il reclutamento di spindlin centrale e PRC1 all'equatore nelle cellule HeLa. [4]

• Saggi chinasici in vitro

  PLK1 e PLK3 vengono aggiunti a piastre di saggio bianche a 384 pozzetti a concentrazioni note variabili in DMSO al 100%. DMSO (1–5% finale) ed EDTA (65 mM) vengono utilizzati come controlli. Il mix di reazione contiene i seguenti componenti a 22°C: 25 mM HEPES (pH 7,2); 15 mM MgCl₂; 1 μM ATP; 0,05 μCi/pozzetto [γ-³³P]ATP (10 Ci/mmol); 1 μM peptide substrato; 0,15 mg/mL albumina sierica bovina; 1 mM DTT; e 2 nM di dominio chinasico PLK1 o 5 nM di PLK3 a lunghezza intera. Il mix di reazione (10 o 20 μL) viene rapidamente aggiunto a ciascun pozzetto immediatamente dopo l'aggiunta dell'enzima tramite manipolatori liquidi automatizzati e incubato per 1-1,5 ore a 22°C. Le reazioni enzimatiche da 20 μL vengono interrotte con 50 μL di mix di arresto [50 mM EDTA, 4,0 mg/mL di perle SPA di streptavidina in Dulbecco

• Linee cellulari

  H460 and HDF cells

• Concentrazioni

  3 μM

• Tempo di incubazione

  72 hours

• Metodo

  H460 cells are plated at a density of 2×10³ per well, HDF cells are plated at 5×10³ per well, and the drug-resistant cell line MES-SA/DX5 and its sensitive parent line MES-SA are plated at 7×10³ and 6×10³ per well, respectively, in a 96-well plate. These densities allow vehicle controls to grow logarithmically during the course of the 3-day assay. All cells are exposed to 3-fold dilutions of GW 843682X (30–0.00152 μM) in low-glucose DMEM containing 5% FBS, and 0.3% (v/v) DMSO (HDF cells); RPMI 1640 containing 5% FBS, and 0.3% (v/v) DMSO (H460); or McCoy's 5A containing 5% FBS, and 0.3% (v/v) DMSO (MES-SA and MES-SA/DX5).