GSK343

GSK343 inibisce la trimetilazione di H3K27 (H3K27me3) con IC50 di 174 nM nelle cellule di cancro al seno HCC1806. Questo composto inibisce potentemente la proliferazione cellulare nelle cellule di cancro al seno e nelle cellule di cancro alla prostata, e la linea cellulare di cancro alla prostata LNCaP è la più sensibile ad esso, con IC50 di 2,9 μM. [1]

Questa sostanza chimica sopprime significativamente la crescita delle cellule EOC coltivate in matrice extracellulare (ECM) di matrigel 3D, che imita il microambiente tumorale in vivo. Inoltre, induce anche l'apoptosi delle cellule EOC in 3D e inibisce significativamente l'invasione delle cellule EOC. [2]

GSK343, un inibitore selettivo di EZH2, inibisce la fagocitosi.

• Saggi biochimici in vitro contro Histone Methyltransferase

  L'attività contro EZH2 viene valutata utilizzando un complesso PRC2 a 5 membri (Flag-EZH2, EED, SUZ12, AEBP2, RbAp48). Il protocollo del saggio può essere riassunto come segue: 10 mM di stock di composti sono preparati da solido in DMSO al 100%. Una piastra master di diluizione seriale a 11 punti viene preparata in formato a 384 pozzetti (diluizione 1:3, le colonne 6 e 18 erano controlli di DMSO di uguale volume) e dispensata su piastre pronte per il saggio utilizzando la tecnologia di dispensazione acustica per creare un timbro di 100 nL di composto e controlli di DMSO. Le aggiunte al saggio consistevano in aggiunte di uguale volume di 10 nM EZH2 e della soluzione di substrato (5 Tµg/mL di nucleosomi HeLa e 0,25 TµM di [³H]-SAM) dispensate nelle piastre di saggio utilizzando un dispensatore combi multidrop. Le piastre di reazione vengono incubate per 1 ora e spente con un'aggiunta di uguale volume di 0,5 mg/mL di perle di imaging PS-PEI (RPNQ0098) contenenti 0,1 mM di SAM non marcato. Le piastre vengono sigillate, adattate al buio per 30 minuti e viene acquisita un'immagine di luminescenza di endpoint di 5 minuti utilizzando un immagine Viewlux. Le statistiche della piastra come Z’ e il rapporto segnale/sfondo, nonché le curve dose-risposta, vengono analizzate utilizzando Activity BaseXE. L'attività biochimica in vitro di EZH1 viene valutata come parte di un complesso PRC2 a 5 membri utilizzando un saggio SPA a 384 pozzetti identico a EZH2. I componenti del tampone, la dispensazione dei reagenti, la preparazione della piastra del composto, le condizioni di spegnimento e l'analisi dei dati sono identici per EZH1 ed EZH2 con concentrazioni finali del saggio di 20 nM EZH1, 5 TµM/mL di nucleosomi HeLa e 0,25 TµM di [³H]-SAM. Ulteriori analisi dei dati, pivot pIC50 e visualizzazioni sono abilitati da TIBCO Spotfire. Questo composto è profilato presso Reaction Biology Corp. (Malvern, PA) per valutare l'inibizione nel loro pannello di saggi di Histone Methyltransferase. L'attività della metiltransferasi viene valutata utilizzando la tecnologia HotSpot, un saggio di legame su filtro miniaturizzato basato su radioisotopi. Gli inibitori vengono sciolti in dimetilsolfossido (DMSO) e testati a concentrazioni fino a 100 uM con una concentrazione finale di DMSO del 2%. Il tampone contenente la metiltransferasi alla concentrazione indicata e il suo substrato preferito, come mostrato nella tabella allegata, viene preincubato con questa sostanza chimica per 10 minuti. Le reazioni vengono avviate mediante l'aggiunta di 1 uM di S-adenosil-L-[metil-³H]metionina (SAM), lasciate incubare per 60 minuti a 30°C, seguite dal trasferimento su carta da filtro P81 e lavaggio con PBS prima del rilevamento.

• Linee cellulari

  Breast cancer cell lines (HCC1806, Sk-Br-3, ZR-75-1), prostate cancer cell lines (DU145, PC3, LNCaP)

• Concentrazioni

  ~50 μM

• Tempo di incubazione

  6 days

• Metodo

  To account for varying doubling rates among cancer cell lines, the optimal cell seeding is determined empirically for all cell lines by examining their growth in a 384-well plate over 6 days with a wide range of seeding densities. Cells are then plated at the optimal seeding density and allowed to adhere overnight. Cells are treated in duplicate with a 20-point 2-fold dilution series of this compound or 0.147% DMSO (vehicle control) and incubated for 6 days at 37C in 5% CO2. Cells are then lysed with 25 μl CellTiter-Glo per well and chemiluminescence is quantified with a TECAN Safire2 microplate reader. In addition, an untreated plate of cells is harvested at the time of compound addition (T0) to quantify the starting number of cells. CTG values after 6 days of treatment were expressed as a percent of the T0 value and plotted against compound concentration. Data are fit with a 4-parameter equation to generate a concentration response curve and the concentration of compound required to inhibit 50% of growth (gIC50) is determined