GSK2606414

Questo composto inibisce l'autofosforilazione di PERK nelle cellule A459 con un IC50 di <0,3 μM. [1]

GSK2606414 mostra un'elevata disponibilità orale e una clearance ematica da bassa a moderata in topi, ratti e cani. Questo composto, somministrato per via orale, inibisce la crescita tumorale in modo dose-dipendente in topi portatori di tumori pancreatici umani BxPC3. [1]

• Saggio della chinasi del reticolo endoplasmatico simile a PKR (PERK) (formato HTRF)

  Il dominio citoplasmatico di GST-PERK viene acquistato. L'eIF2α umano a lunghezza intera con 6-His viene purificato dall'espressione di baculovirus in cellule di insetto Sf9. La proteina eIF2α viene scambiata da tampone mediante dialisi in PBS, modificata chimicamente da NHS-LC-biotina e quindi scambiata da tampone mediante dialisi in 50 mM Tris, pH 7.2, 250 mM NaCl, 5 mM DTT. La proteina viene aliquota e conservata a -80 °C. La soluzione di quench viene preparata al momento e, una volta aggiunta alla reazione, produce concentrazioni finali di 4 nM di anticorpo eIF2α fosfo-ser51, 4 nM di IgG anti-coniglio marcata Eu-1024, 40 nM di streptavidina Surelight APC e 15 mM di EDTA. Le reazioni sono state eseguite in piastre nere di polistirolo a 384 pozzetti a basso volume in un volume finale di 10 μL. Il volume di reazione contiene, in concentrazioni finali, 10 mM HEPES, 5 mM MgCl₂, 5 μM ATP, 1 mM DTT, 2 mM CHAPS, 40 nM di eIF2α 6-His biotinilato e 0,4 nM di GST-PERK. I composti in analisi vengono sciolti in DMSO a 1,0 mM e diluiti in serie 1–3 con DMSO attraverso 11 diluizioni. Una quantità di 0,1 μL di ciascuna concentrazione viene trasferita nel pozzetto corrispondente di una piastra di saggio. Ciò crea un intervallo di concentrazione finale del composto da 0,00017 a 10 μM. La soluzione di GST-PERK viene aggiunta alle piastre di saggio contenenti i composti e preincubata per 30 min a temperatura ambiente. La reazione viene avviata con l'aggiunta di ATP e della soluzione di substrato eIF2α. Dopo 1 h di incubazione, viene aggiunta la soluzione di quench. Le piastre vengono coperte per 2 h a temperatura ambiente prima della determinazione del segnale. Il segnale risultante viene quantificato su un lettore Viewlux. Il segnale APC viene normalizzato al segnale di europio trasformando i dati mediante un calcolo APC/Eu. I dati per le curve di risposta alla concentrazione sono rappresentati come % di inibizione calcolato con la formula di riduzione dei dati 100 × [1 – (U1 – C2)/(C1 – C2)] rispetto alla concentrazione del composto dove U è il valore sconosciuto, C1 è il valore di controllo medio ottenuto per l'1% di DMSO e C2 è il valore di controllo medio ottenuto per 0,1 M di EDTA. I dati vengono adattati con una curva descritta da dove A è la risposta minima, B è la risposta massima, D è il fattore di pendenza, x è la concentrazione del composto e C è l'IC50. I risultati per ciascun composto sono registrati come valori di IC50.

• Linee cellulari

  A549 cells

• Concentrazioni

  0.3 μM

• Tempo di incubazione

  2 h

• Metodo

  Cells were incubated with PERK inhibitor (GSK2606414, compound 38) and then stimulated with thapsigargin. After 2 h, the cells were lysed and analyzed for inhibition of PERK autophosphorylation.

• Modelli animali

  BxPC3 human pancreatic xenograft model

• Dosaggi

  ~150 mg/kg

• Somministrazione

  Oral administration