GSK2334470

GSK2334470 inibisce PDK1 dall'attivare Akt1 a lunghezza intera in presenza di vescicole lipidiche contenenti PtdIns(3,4,5)P₃ o un mutante di Akt1 privo del dominio PH (ΔPH-Akt1) con IC50 di ~10 nM. Questo composto inibisce anche in modo simile PDK1 dal fosforilare il substrato peptidico PDKtide con IC50 di ~10 nM. Esso (0,1 μM–0,3 μM) induce una significativa inibizione dose-dipendente di NDRG1 endogeno con oltre il 50% di riduzione della fosforilazione nelle cellule HEK-293. Questa sostanza chimica (30 nM) induce una significativa inibizione dose-dipendente della fosforilazione del T-loop di ciascuna isoforma di SGK nelle cellule HEK-293. Esso (1 μM) inibisce la fosforilazione del motivo idrofobico di S6K1 in misura simile alla fosforilazione del T-loop nelle cellule HEK-293. Questo composto (3 μM) sopprime anche l'attività e la fosforilazione di S6K1 indotte dalla stimolazione con IGF1 di cellule HEK-293 private di siero. Esso (3 μM) inibisce marcatamente la fosforilazione di diversi substrati di Akt [FoxO (forkhead box O), GSK3 e PRAS40]. Questa sostanza chimica (3 μM) induce anche un'inibizione quasi massima dell'attività e della fosforilazione di Akt1 entro 5 minuti, e la fosforilazione del substrato di Akt (FoxO, GSK3 e PRAS40) viene inibita in un momento leggermente successivo (10 minuti). Esso (0,3 μM) inibisce significativamente la fosforilazione di Akt o PRAS40/GSK3 nelle cellule ES knock-in PDK1K^465E/K465E ma non nelle cellule ES wild-type. Questo composto (1 μM) sopprime efficacemente l'attività di SGK1, come giudicato dall'inibizione della fosforilazione di NDRG1 nelle cellule di glioblastoma U87. Esso (1 μM) sopprime anche potentemente l'attivazione di S6K1 (Figura 7B) così come di SGK1 nelle cellule MEF (fibroblasti embrionali di topo). Questa sostanza chimica (0,1 μM) induce ~50% di inibizione dell'attività di RSK2 nelle cellule HEK-293. [1]

Esso (30 μM) sopprime la forza Ca²⁺-sensibilizzata indotta da U46619 nel muscolo liscio dell'arteria polmonare di coniglio permeabilizzato con α-tossina. Questo composto (30 μM) determina una significativa diminuzione della forza contrattile in risposta a [Ca²⁺]. [2]

Esso (1 μM) porta alla totale abrogazione dell'aumento intracellulare di calcio indotto da EGF e all'accumulo di fosfati di inositolo nelle cellule MDA-MB-231. Questa sostanza chimica (1 μM) inibisce la fosforilazione di PLCγ1 Tyr783 nelle cellule MDA-MB-231. [3]

Questo composto è un inibitore altamente specifico e potente di PDK1.

• Saggi di attività chinasica

  Akt, S6K e RSK endogeni vengono immunoprecipitati da 0,1 mg a 1 mg di lisato cellulare per 2 ore a 4 °C su una piattaforma vibrante utilizzando 3 μg–5 μg degli anticorpi indicati. Per i saggi di attività SGK, 150 μg di lisato trasfettato vengono incubati con 5 μg di glutatione–Sepharose per 3 ore a 4 °C. Gli immunoprecipitati vengono lavati due volte con tampone di lisi contenente 0,5 mM NaCl, seguiti da due lavaggi con tampone di chinasi. Le reazioni di chinasi vengono avviate con una miscela di reazione per portare le concentrazioni finali dei componenti della reazione a 0,1 mM [γ-³²P]ATP (~200 c.p.m./pmol), 5 mM di acetato di magnesio, 0,1% di 2-mercaptoetanolo e 30 mM di peptide Crosstide (GRPRTSSFAEGKK). Le reazioni vengono condotte per 20 minuti a 30 °C su una piattaforma vibrante e interrotte applicando le reazioni su carta fosfocellulosa P81. La conta Cerenkov viene eseguita dopo aver lavato le carte in acido fosforico, risciacquato in acetone e asciugato all'aria. Un'unità di attività è definita come quella che ha catalizzato l'incorporazione di 1 nmol di [³²P]fosfato nel substrato in 1 ora.

• Linee cellulari

  MDA-MB-231 cells

• Concentrazioni

  1 µM

• Tempo di incubazione

  30 minutes

• Metodo

  Cells were incubated with 1 µM of GSK2334470 for 30 minutes. Cells treated with DMSO were used as control.

• Modelli animali

  Nude mice

• Dosaggi

  100 mg/kg

• Somministrazione

  i.p.