GSK1070916

La capacità di GSK1070916 di inibire gli enzimi Aurora viene misurata utilizzando saggi di chinasi in vivo. I saggi misurano la capacità di Aurora A, Aurora B e Aurora C di fosforilare un substrato peptidico sintetico. Biotin-Ahx-RARRRLSFFFFAKKK-NH2 viene utilizzato per il saggio Aurora A–TPX2 LEADseeker^TM e 5FAM-PKAtide viene utilizzato per il saggio IMAP^TM per tutte e tre le chinasi Aurora. Per tenere conto dell'inibizione tempo-dipendente degli enzimi Aurora, Aurora A–TPX2, Aurora B–INCENP e Aurora C–INCENP vengono incubati con questo composto a varie concentrazioni per 30 min prima che le reazioni vengano avviate con l'aggiunta di substrati. Per il saggio Aurora A LEADseeker^TM, le condizioni finali del saggio sono 0,5 nM Aurora A–TPX2, 1 μM di substrato peptidico, 6 mM di MgCl₂, 1,5 μM di ATP, 0,003 μCi/μL di [γ-³³P] ATP in 50 mM di Hepes, pH 7,2, 0,15 mg/mL di BSA, 0,01% di Tween-20, 5 mM di DTT e 25 mM di KCl. Le reazioni vengono incubate a temperatura ambiente (25 °C) per 120 min e terminate con l'aggiunta di microsfere LEADseeker^TM in PBS contenente EDTA (concentrazione finale 2 mg/mL di microsfere e 25 mM di EDTA). Le piastre vengono quindi sigillate e le microsfere vengono lasciate decantare durante la notte. La formazione del prodotto viene quantificata utilizzando un Viewlux Imager. Per i saggi IMAP^TM, Aurora A–TPX2 (concentrazione finale 1 nM), Aurora B–INCENP (concentrazione finale 2 nM) o Aurora C–INCENP (concentrazione finale 2,5 nM) viene aggiunto alle piastre contenenti il composto in 5 μL di tampone (25 mM Hepes, pH 7,2, per Aurora A, 25 mM Hepes, pH 7,5, per Aurora B e 20 mM Hepes, pH 7,2, per Aurora C) contenente 0,15 mg/mL di BSA, 0,01% di Tween 20 e 25 mM di NaCl. Questa miscela viene incubata a temperatura ambiente per 30 min. Per avviare la reazione, vengono aggiunti 5 μL di una soluzione di substrato contenente lo stesso tampone Hepes utilizzato per la pre-incubazione, 25 mM di NaCl, MgCl₂ (2, 4 e 4 mM per Aurora A, B e C rispettivamente), DTT (4, 4 e 2 mM per Aurora A, B e C rispettivamente), ATP (4, 4 e 10 μM per Aurora A, B e C rispettivamente), 200 nM di 5FAM-PKAtide, 0,01% di Tween 20 e 0,15 mg/mL di BSA. Le reazioni vengono incubate a temperatura ambiente per 120 min per Aurora A e B e 60 min per Aurora C. Queste reazioni vengono quindi terminate con l'aggiunta di 10 μL di 1:500 (1:600 per Aurora C) di Progressive Binding Reagent in 95% Progressive Binding Buffer A e 5% Progressive Binding Buffer B. Le piastre vengono incubate a temperatura ambiente per circa 90–120 min (tempo consentito per il raggiungimento dell'equilibrio). Le piastre vengono lette in un lettore di piastre Molecular Devices Analyst in modalità di polarizzazione della fluorescenza.

SW48, Colo 201, SW480, WiDr, Colo205, RKO E6, RKO, LoVo, HCT-116, SW620, HT29, W1417, DLD-1, HCT-8, Colo 320HSR, Hep-3B, OVCAR-3, MEC-1 cells

0-15 mM

6-7 days

Cells are plated in 96-well plates in the recommended growth media and incubated at 37 °C in 5% CO₂ overnight. The following day, the cells are treated with serial dilutions of GSK1070916. At this time, one set of cells is treated with CellTiter-Glo for a time equal to 0 (T = 0) measurement. Following a 6- to 7-d incubation with this compound, cell proliferation is measured using the CellTiter-Glo reagent according to the manufacture's recommended protocol. As inhibition of Aurora B induces endomitosis, the degree of which differs depending on the cell type, an extended compound treatment time is required to accurately reflect the effects on cell viability across a large panel of cell lines. For analysis of cell viability, values from wells with no cells are subtracted for background correction and the data plotted as a percent of the DMSO-treated control samples using Microsoft Excel XLfit4 software. The EC50 values represent the concentration of this compound where 50% maximal effect is observed

Mice tumor xenograft models (A549, SW620, HCT116, H460, MCF-7, HL60, K562, Colo205)

25, 50, or 100 mg/kg

Administered via i.p. once daily