Fluorescein-5-isothiocyanate (FITC)

1.Preparazione delle proteine
1) Per ottenere il miglior effetto di marcatura, preparare la concentrazione di proteine (anticorpi) a 2 mg/mL.
2) Il valore di pH della soluzione proteica deve essere 8,5 ± 0,5. Se il pH è inferiore a 8,0, utilizzare 1M di bicarbonato di sodio per la regolazione.
3) Se la concentrazione di proteine è inferiore a 2 mg/ml, l'efficienza di marcatura sarà notevolmente ridotta. Per ottenere la migliore efficienza di marcatura, si raccomanda che l'intervallo di concentrazione finale delle proteine sia di 2-10 mg/mL.
4) La proteina deve essere nel tampone senza ammina primaria (come Tris o glicina) e ioni ammonio, altrimenti l'efficienza di marcatura sarà influenzata.
2.Preparazione del colorante
Aggiungere DMSO anidro nel flaconcino di Fluorescein-5-isothiocyanate (FITC) per preparare una soluzione madre da 10 mM. Mescolare bene pipettando o con un vortex.
3.Calcolo del dosaggio del colorante
La quantità di questo composto necessaria per la reazione dipende dalla quantità di proteina da marcare, e il rapporto molare ottimale tra esso e la proteina è di circa 10.
Esempio: supponendo che la proteina marcatore richiesta sia 1 mL 2 mg/mL IgG (MW=150.000), utilizzare 1 mL di DMSO per sciogliere 1 mg di FITC, il volume richiesto è 40 μL.
4.Esecuzione della reazione di coniugazione
1) Un buon volume di FITC da 10 mg/mL appena preparato viene aggiunto lentamente a 0,5 mL di campione proteico. In soluzione, agitare delicatamente per mescolare, quindi centrifugare brevemente per raccogliere il campione sul fondo della provetta di reazione. Non mescolare troppo per evitare la denaturazione e l'inattivazione dei campioni proteici.
2) Le provette di reazione sono state poste in un luogo buio e incubate delicatamente a temperatura ambiente per 60 minuti a intervalli. Per 10-15 minuti, invertire delicatamente le provette di reazione più volte per mescolare completamente i due reagenti e aumentare l'efficienza della barra.
5.Purificazione della coniugazione
Il seguente protocollo è un esempio di purificazione del coniugato colorante-proteina utilizzando una colonna Sephadex G-25.
1) Preparare la colonna Sephadex G-25 secondo le istruzioni del produttore.
2) Caricare la miscela di reazione (da ""Esecuzione della reazione di coniugazione"") sulla parte superiore della colonna Sephadex G-25.
3) Aggiungere PBS (pH 7,2-7,4) non appena il campione scende appena sotto la superficie superiore della resina.
4) Aggiungere più PBS (pH 7,2-7,4) al campione desiderato per completare la purificazione della colonna.
Combinare le frazioni che contengono il coniugato colorante-proteina desiderato.