EPZ004777

EPZ004777 viene diluito in serie 3 volte in DMSO per un totale di dieci concentrazioni, a partire da 1 mM. Un'aliquota di 1 μL di ciascuna diluzione dell'inibitore viene piastrata in una piastra di microtitolazione a 384 pozzetti. Il controllo di inibizione al 100% consisteva in una concentrazione finale di 2,5 mM dell'inibitore del prodotto S-adenosil-L-omocisteina (SAH). Questo composto viene incubato per 30 minuti con 40 ml per pozzetto di 0,25 nM DOT1L(1-416) in tampone di saggio (20 mM TRIS [pH 8.0] 10 mM NaCl, 0.002% Tween 20, 0.005% gelatina di pelle bovina, 100 mM KCl e 0.5 mM DTT). Vengono aggiunti 10 ml per pozzetto di miscela di substrato comprendente tampone di saggio con 200 nM di ³H-SAM (American Radiolabeled Chemicals: 80 Ci/mmol), 600 nM di SAM non marcato e 20 nM di nucleosomi per avviare la reazione (entrambi i substrati sono presenti nella miscela di reazione finale ai loro rispettivi valori di KM). Le reazioni vengono incubate per 120 minuti e bloccate con 10 ml per pozzetto di 800 mM SAM. L'incorporazione di radioattività nel substrato di nucleosomi viene misurata in una flashplate. I valori di IC50 per gli enzimi nel pannello Histone Methyltransferase vengono determinati in condizioni di saggio equilibrate simili con SAM e il substrato proteico/peptidico presenti a concentrazioni pari ai loro rispettivi valori di KM.

Human leukemia cell lines MV4-11, THP-1, RS4;11, Kasumi-1, HL-60, REH, and Jurkat. SEM, KOPN-8, 697, U937 and MOLM-13 cells.

~50 μM

14-18 days

For assessment of cell proliferation and viability in human cell lines, exponentially growing cells are plated, in triplicate, in 96-well plates in a final volume of 150 ml. Cells are incubated in the presence of 3 μM (proliferation curve), or increasing concentrations (IC50 determination) of EPZ004777 up to 50 μM. Viable cell number is determined every 3–4 days for up to 18 days using the Guava Viacount assay and analyzed on a Guava EasyCyte Plus instrument according to the manufacturer’s protocol. On days of cell counts, growth media and this compound are replaced and cells split back to a density of 5×10⁴ cells/well. Total cell number is expressed as split-adjusted viable cells per well. For each cell line, IC50 values are determined from concentration-dependence curves at each time point using Graphpad Prism software. Experiments to determine IC50 values continues until IC50 values stabilized (day 18 for THP-1 cells, day 14 for all other cell lines). For assessment of the effect of this compound treatment on transformed murine hematopoietic progenitors, cells from two independent transductions for each virus are plated in 24-well plates at a density of 0.5–1×10⁵ cell/well in 1 ml media in 24-well plates and exposed to increasing concentrations of this chemical up to 30 mM. Cells are counted and replated at equal cell numbers in fresh media with fresh compound every 3–4 days. For MTT assays, cells from serial replatings are harvested on day 10 and plated, in triplicate at 2×10⁴ cells/well in 100 ml media with the appropriate concentration of this compound. Cells are incubated for 2.5 days, the exposed to 10 ml MTT reagent for 3 hr, and lysed over night in 100 ml MTT- solubilization buffer (both from Cell Proliferation Kit I [MTT]).

A mouse xenograft MV4-11 model of MLL.

Mini-pumps containing 100 and 150 mg/mL EPZ004777 solutions

Osmotic pump