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Descrizione biologica
| Specificità | E.coli LPS Antibody [M15H2] rileva specificamente E.coli LPS. |
|---|---|
| Contesto | Il LPS (Lipopolisaccaride) di E. coli costituisce il componente strutturale primario e la potente endotossina della membrana esterna batterica Gram-negativa, comprendente il Lipide A, l'oligosaccaride del core e l'antigene O che mantengono collettivamente l'integrità della membrana fungendo al contempo da molecola immunostimolante più potente conosciuta. Il Lipide A si ancora come un disaccaride di β-1',6-glucosamina bifosforilato acilato con sei catene di acidi grassi che formano la porzione tossica riconosciuta dal complesso recettore TLR4-MD-2-CD14 dell'ospite, mentre la regione del core si lega tramite zuccheri Kdo-eptosio che portano gruppi fosfato/etanolammina carichi per la stabilizzazione della membrana, e la catena polisaccaridica altamente variabile dell'antigene O di epitopi ripetuti conferisce specificità di sierotipo ed evasione immunitaria attraverso la resistenza alla fagocitosi/complemento creando una morfologia batterica "liscia". Il LPS forma una barriera di permeabilità essenziale che protegge contro i sali biliari, gli antibiotici e i peptidi cationici, innescando al contempo una catastrofica attivazione immunitaria innata attraverso le vie NF-κB e IRF3 dipendenti da MyD88/TRIF che guidano massicce tempeste di citochine TNF-α, IL-1β, IL-6 che precipitano shock settico, coagulazione intravascolare disseminata e insufficienza multiorgano durante la batteriemia Gram-negativa; l'endotossemia cronica di basso grado da traslocazione intestinale contribuisce all'aterosclerosi, alle malattie neurodegenerative e alla sindrome metabolica tramite infiammazione vascolare sostenuta, posizionando il LPS come un elemento strutturale batterico indispensabile e il tossina microbica più pericolosa per l'umanità. |
Informazioni sullutilizzo
| Applicazione | IF, ELISA | Diluizione |
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|---|---|---|---|---|---|
| Reattività | Escherichia coli | ||||
| Fonte | Mouse Monoclonal Antibody | MW | |||
| Tampone di conservazione | PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 | Conservazione (Dalla data di ricevimento) |
-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years | ||
| IF |
Experimental Protocol:
Sample Preparation
1. Adherent Cells: Place a clean, sterile coverslip in a culture dish. Once the cells grow to near confluence as a monolayer, remove the coverslip for further use.
2. Suspension Cells: Seed the cells onto a clean, sterile slide coated with poly-L-lysine.
3. Frozen Sections: Allow the slide to thaw at room temperature. Wash it with pure water or PBS for 2 times, 3 minutes each time.
4. Paraffin Sections: Deparaffinization and rehydration. Wash the slide with pure water or PBS for 3 times, 3 minutes each time. Then perform antigen retrieval.
Fixation
1. Fix the cell coverslips/spots or tissue sections at room temperature using a fixative such as 4% paraformaldehyde (4% PFA) for 10-15 minutes.
2. Wash the sample with PBS for 3 times, 3 minutes each time.
Permeabilization
1.Add a detergent such as 0.1–0.3% Triton X-100 to the sample and incubate at room temperature for 10–20 minutes.
(Note: This step is only required for intracellular antigens. For antigens expressed on the cell membrane, this step is unnecessary.)
Wash the sample with PBS for 3 times, 3 minutes each time.
Blocking
Add blocking solution and incubate at room temperature for at least 1 hour. (Common blocking solutions include: serum from the same source as the secondary antibody, BSA, or goat serum.)
Note: Ensure the sample remains moist during and after the blocking step to prevent drying, which can lead to high background.
Immunofluorescence Staining (Day 1)
1. Remove the blocking solution and add the diluted primary antibody.
2. Incubate the sample in a humidified chamber at 4°C overnight.
Immunofluorescence Staining (Day 2)
1. Remove the primary antibody and wash with PBST for 3 times, 5 minutes each time.
2. Add the diluted fluorescent secondary antibody and incubate in the dark at 4°C for 1–2 hours.
3. Remove the secondary antibody and wash with PBST for 3 times, 5 minutes each time.
4. Add diluted DAPI and incubate at room temperature in the dark for 5–10 minutes.
5. Wash with PBST for 3 times, 5 minutes each time.
Mounting
1. Mount the sample with an anti-fade mounting medium.
2. Allow the slide to dry at room temperature overnight in the dark.
3. Store the slide in a slide storage box at 4°C, protected from light.
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Riferimenti
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