Dyngo-4a (Hydroxy-Dynasore)

L'attività della Dynamina I viene misurata nel suo stato di attività SAI o è stimolata da tre diversi metodi. Poiché ogni stimolo attiva la dinamina a diverse estensioni, ogni test richiede diverse concentrazioni di dinamina. In primo luogo, l'attività massima della dinamina è stimolata da liposomi PS sonicati. La Dynamina I purificata (10–20 nM, diluita in: 6 mM Tris–HCl, 20 mM NaCl e 0,01% Tween 80, pH 7,4) viene incubata in piastre a 96 pozzetti in tampone GTPasi (5 mM Tris–HCl, 10 mM NaCl, 2 mM Mg²⁺, 0,05% Tween 80, pH 7,4, 1 µg/mL leupeptina e 0,1 mM PMSF) e 0,3 mM GTP in presenza del composto test per 30 min a 37°C in un volume di saggio finale di 150 μL. Le reazioni vengono interrotte con 10 μL di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) 0,5 M pH 7,4 e viene aggiunta soluzione di Verde Malachite (40 μL: 2% p/v tetraidrato di molibdato di ammonio, 0,15% p/v verde malachite e 4 M HCl) per 5 min. In secondo luogo, la dinamina (20 nM) viene stimolata da 10 µg/mL di microtubuli preformati di cervello bovino stabilizzati con taxolo utilizzando lo stesso protocollo. In terzo luogo, la dinamina I (50 nM) viene stimolata da 1 μM di grb2 ricombinante, una proteina contenente SH3 che stimola la dinamina circa 5–10 volte meno efficacemente dei liposomi o dei microtubuli. Infine, l'attività SAI della dinamina (500 nM) viene misurata utilizzando alte concentrazioni di dinamina, che promuovono la sua auto-assemblaggio cooperativo in anelli (ma non in eliche). La concentrazione finale di DMSO nei test GTPasi o di endocitosi è al massimo del 3,3 o 1%, rispettivamente, ma tipicamente dell'1%. Il test GTPasi per la dinamina I non è influenzato dal DMSO fino al 3,3%. I composti vengono sciolti come soluzioni stock da 30 mM in DMSO al 100%. Queste soluzioni stock possono essere conservate a -20°C per diversi mesi. I composti vengono successivamente diluiti in soluzioni di DMSO al 50% preparate in 20 mM Tris–HCl pH 7,4 e diluiti nuovamente nel test finale. Per l'analisi della cinetica di inibizione di questo composto, la dinamina I a una concentrazione finale di 17 nM viene incubata con tampone GTPasi contenente PS (2 µg/mL) e quantità variabili di GTP (50–250 μM) in presenza di questa sostanza chimica in un intervallo di concentrazione tra 0,5 e 6 μM. La reazione viene interrotta dopo 30 min con l'aggiunta di EDTA (0,5 mM, pH 7,4). Le curve vengono generate utilizzando l'equazione di Michaelis–Menten v = Vmax[S]/(Km + [S]), dove S è il substrato GTP. Dopo che i valori di Vmax e Km sono stati determinati, i dati sono stati trasformati utilizzando l'equazione di Lineweaver–Burke, 1/v = 1/Vmax + (Km/Vmax)(1/[S]). Le condizioni del test si basano sul test della dinamina I ma contenevano modifiche. La dinamina II ricombinante viene utilizzata a 50 nM, stimolata da 10 µg/mL di PS. La reazione GTPasi è consentita per 90 min a 37°C prima della terminazione.

αT3–1 or LβT2 cells

30 μM

30 minutes

αT3-1 or LβT2 cells (2 × 10⁶) were grown overnight in a 6-well culture dish and then serum starved for 2–4 hours. Cells were pretreated with either vehicle (0), dynasore (80μM), or dyngo (30μM) for 30 minutes. For dose-response studies, indicated doses of this compound were used for a 30-minute pretreatment. After pretreatment, cells were treated with 0 or GnRHa (10 nM) for 10 minutes. Cells were then washed twice in PBS, lysed in radio-immunoprecipitation assay (RIPA) buffer and subjected to SDS-PAGE (acrylamide:bis-acrylamide ratio of 29:1) and electroblotted to polyvinylidene difluoride membranes.

Female CD-1 mice

30 mg/kg

i.p.