DAPT

Cellule renali embrionali umane (American Type Culture Collection CRL-1573), trasfettate con il gene per APP751 (HEK 293) sono utilizzate per saggi di routine di riduzione di Aβ. Le cellule vengono piastrate in piastre a 96 pozzetti e lasciate aderire durante la notte in terreno di Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) integrato con 10% di siero bovino fetale inattivato dal calore. DAPT viene diluito da soluzioni stock in dimetilsolfossido (DMSO) per ottenere una concentrazione finale pari allo 0,1% di DMSO nel terreno. Le cellule vengono pretrattate per 2 ore a 37 °C con questo composto, i terreni vengono aspirati e vengono applicate nuove soluzioni del composto. Dopo un ulteriore periodo di trattamento di 2 ore, il terreno condizionato viene prelevato e analizzato mediante un ELISA sandwich (266–3D6) specifico per l'Aβ totale. La riduzione della produzione di Aβ viene misurata rispetto alle cellule di controllo trattate con lo 0,1% di DMSO ed espressa come percentuale di inibizione. I dati di almeno sei dosi in duplicato vengono adattati a un modello logistico a quattro parametri utilizzando il software XLfit al fine di determinare la potenza. Le colture neuronali umane e di topo PDAPP vengono coltivate in terreno privo di siero per migliorarne le caratteristiche neuronali e risultano essere superiori al 90% di neuroni dopo la maturazione prima dell'uso. I terreni condizionati per stabilire i valori basali di Aβ vengono raccolti aggiungendo terreno fresco a ogni pozzetto e incubati per 24 ore a 37 °C in assenza di questo composto chimico. Le colture vengono quindi trattate con terreno fresco contenente questo composto nell'intervallo di concentrazioni desiderato per ulteriori 24 ore a 37 °C, e i terreni condizionati vengono raccolti. Per la misurazione dell'Aβ totale, i campioni vengono analizzati con lo stesso ELISA (266–3D6) utilizzato per i saggi sulle cellule HEK 293. Le analisi dei campioni per la produzione di Aβ42 vengono eseguite mediante un ELISA separato (21F12–3D6) che utilizza un anticorpo di cattura specifico per il C-terminale di Aβ42. L'inibizione della produzione sia di Aβ totale che di Aβ42 è determinata dalla differenza tra i valori del trattamento con il composto e i periodi basali. Dopo aver tracciato la percentuale di inibizione in funzione della concentrazione di questo composto, i dati vengono analizzati con il software XLfit, come sopra, per determinare la potenza.

SK-MES-1

2.5 μM to 160 μM

72 hours

Cells are seeded into 96-well plates and exposed to 0.1% DMSO or DAPT at concentrations in the range of 2.5 μM–160 μM for 72 hours. Cytotoxicity is determined with 3-(4, 5)-dimethylthiahiazo-(-z-y1)-3, 5-di-phenytetrazoliumromide (MTT) dye reduction assay with minor modifications. Briefly, after incubation with this compound, 20 μL MTT solution (5 mg/mL in PBS) is added to 180 μL medium in each well and plates are incubated for 4 hours at 37 °C, and subsequently 150 μL DMSO is added to each well, and mixed by shaking at room temperature for 15 minutes. Absorption is measured by an enzyme-linked immunosorbent assay at 490 nm to determine absorbance values. α-MEM supplemented with the same amount of MTT solution and solvent is used as blank solution. The IC50 value is calculated using PROBIT program in SPSS.

Heterozygous PDAPP transgenic mice overexpressing the APPV717F mutant form of the amyloid precursor protein.

≤100 mg/kg

Administered via p.o.