Cyclosporin A

La Cyclosporin A si lega alla ciclofilina (immunofilina) nelle cellule T[1], forma un complesso ciclosporina-composto che si lega e inibisce la calcineurina. [2] Questa sostanza chimica inibisce la calcineurina con un IC50 di 7 nM[3], quindi blocca la traslocazione nucleare di NF-AT. [4] Colpisce anche i mitocondri prevenendo l'apertura del MTP (poro di transizione della permeabilità mitocondriale) con un IC50 di 39 nM. [5]

La Cyclosporin A è un agente immunosoppressore efficace sia per somministrazione parenterale che orale in topi, ratti e cavie. [6], è clinicamente utilizzata nei trapianti d'organo per prevenire il rigetto. [7]

• Saggio phosphatase

  Vengono acquistate calcineurina e calmodulina purificate dal cervello bovino. Le miscele di reazione con enzima purificato contengono 100 nM di calcineurina, 100 nM di calmodulina e 5 μM di fosfopeptide marcato con ³²P, in 60 μl (volume totale) di tampone di saggio contenente 20 mM Tris (pH 8), 100 mM NaCl, 6 mM MgCl₂, 0,5 mM ditiotreitolo, 0,1 mg di albumina di siero bovino per ml, e o 0,1 mM CaCl₂ o 5 mM EGTA. Le miscele di reazione con lisati cellulari contengono 20 μl di lisato non diluito, 5 μM di fosfopeptide marcato con ³²P e 40 μl di tampone di saggio. Dove indicato, le miscele di reazione contengono 50 μM di peptide 412 o 413 e/o 500 nM di acido okadaico, un inibitore specifico delle fosfatasi 1 e 2A; 500 nM di acido okadaico sono sufficienti per l'inibizione delle fosfatasi Ca²⁺-indipendenti, mentre concentrazioni più elevate inibiscono parzialmente anche l'attività Ca²⁺-dipendente. Dopo 15 minuti a 30°C, le reazioni vengono terminate con l'aggiunta di 0,5 ml di tampone fosfato di potassio 100 mM (pH 7,0) contenente il 5% di acido tricloroacetico. Il fosfato inorganico libero viene isolato mediante cromatografia a scambio cationico Dowex e quantificato mediante conteggio per scintillazione come descritto.

• Linee cellulari

  Jurkat cells (clone J77)

• Concentrazioni

  ~100 nM

• Tempo di incubazione

  1 hr

• Metodo

  Immunosuppressive agents are dissolved in ethanol at concentrations 1000-fold more than the concentration desired for cell treatments. Cells (10⁶) are suspended in 1 ml of complete medium in microcentrifuge tubes; 1 μl of ethanol or of the ethanolic solution of Cyclosporin A is added, and the cells are incubated at 37°C for 1 hr. Cells are washed twice with 1 ml of PBS on ice and lysed in 50μl of hypotonic buffer containing 50 mM Tris (pH 7.5); 0.1 mM EGTA; 1 mM EDTA; 0.5 mM dithiothreitol; and 50 μg of phenylmethylsulfonyl fluoride, 50 μg of soybean trypsin inhibitor, 5 μg of leupeptin, and 5 μg of aprotinin per ml. Lysates are subjected to three cycles of freezing in liquid nitrogen followed by thawing at 30°C and then are centrifuged at 4°C for 10 min at 12,000×g.

• Modelli animali

  Rat

• Dosaggi

  45 mg/kg

• Somministrazione

  orally