Crizotinib hydrochloride

Il PF-2341066 mostra una potenza simile contro la fosforilazione di c-Met in cellule epiteliali di topo mIMCD3 o canine MDCK con IC50 di 5 nM e 20 nM, rispettivamente. Il PF-2341066 mostra un'attività migliorata o simile contro le cellule NIH3T3 ingegnerizzate per esprimere i mutanti del sito di legame dell'ATP di c-Met V1092I o H1094R o il mutante del P-loop M1250T con IC50 di 19 nM, 2 nM e 15 nM, rispettivamente, rispetto alle cellule NIH3T3 che esprimono il recettore wild-type con IC50 di 13 nM. Al contrario, si osserva un notevole spostamento della potenza del PF-2341066 contro le cellule ingegnerizzate per esprimere i mutanti del loop di attivazione di c-Met Y1230C e Y1235D con IC50 di 127 nM e 92 nM, rispettivamente, rispetto al recettore wild-type. Il PF-2341066 previene anche potentemente la fosforilazione di c-Met nelle cellule NCI-H69 e HOP92, con IC50 di 13 nM e 16 nM, rispettivamente, che esprimono le varianti endogene di c-Met R988C e T1010I, rispettivamente. Il PF-2341066 è >1.000 volte selettivo per i RTK VEGFR2 e PDGFRβ, >250 volte selettivo per IRK e Lck, e ~40-60 volte selettivo per Tie2, TrkA e TrkB, tutti rispetto a c-Met. Il PF-2341066 è 20-30 volte selettivo per i RTK RON e Axl. Al contrario, il PF-2341066 mostra un IC50 quasi equivalente di 24 nM contro la variante di fusione oncogenica di ALK RTK, nucleofosmina (NPM)-anaplastic lymphoma kinase (ALK), espressa dalla linea cellulare di linfoma anaplastico a grandi cellule (ALCL) umano KARPAS299. Il PF-2341066 inibisce i fenotipi neoplastici c-Met-dipendenti delle cellule tumorali e i fenotipi angiogenici delle cellule endoteliali. Il PF-2341066 sopprime la crescita delle cellule di carcinoma gastrico umano GTL-16 con IC50 di 9,7 nM. Il PF-2341066 induce l'apoptosi nelle cellule GTL-16 con IC50 di 8,4 nM. Il PF-2341066 inibisce la migrazione e l'invasione delle cellule di carcinoma polmonare umano NCI-H441 stimolate dall'HGF con IC50 di 11 nM e 6,1 nM, rispettivamente. Il PF-2341066 inibisce lo scattering delle cellule MDCK con IC50 di 16 nM. Il PF-2341066 previene la fosforilazione di c-Met stimolata dall'HGF, la sopravvivenza cellulare e l'invasione di Matrigel con IC50 di 11 nM, 14 nM e 35 nM, rispettivamente. Inoltre, il PF-2341066 previene la tubulogenesi ramificata delle HMVEC stimolata dal siero (formazione di tubi vascolari) in gel di fibrina.[4]

Nel modello GTL-16, PF-2341066 rivela la capacità di causare una marcata regressione di grandi tumori stabiliti (>600 mm3) in entrambe le coorti di trattamento da 50 mg/kg/die e 75 mg/kg/die, con una diminuzione del 60% del volume tumorale medio nel corso del programma di somministrazione di 43 giorni. In un altro studio, PF-2341066 mostra la capacità di inibire completamente la crescita tumorale di GTL-16 per >3 mesi, con solo 1 topo su 12 che mostra un aumento significativo della crescita tumorale nel corso del programma di trattamento di 3 mesi a 50 mg/kg/die. Nel modello NSCLC NCI-H441, si osserva una diminuzione del 43% del volume tumorale medio a 50 mg/kg/die durante il ciclo di somministrazione di PF-2341066 di 38 giorni. Nel modello RCC Caki-1, si osserva una diminuzione del 53% del volume tumorale medio associata a una diminuzione del volume di ciascun tumore di almeno il 30% a 50 mg/kg/die durante il ciclo di somministrazione di PF-2341066 di 33 giorni. PF-2341066 rivela anche una prevenzione quasi completa della crescita di tumori stabiliti a 50 mg/kg/die nei modelli di xenotrapianto di glioblastoma U87MG o carcinoma prostatico PC-3, con il 97% o l'84% di inibizione nell'ultimo giorno dello studio, rispettivamente. Al contrario, PF-2341066 p.o. somministrato a 50 mg/kg/die non inibisce significativamente la crescita tumorale nel modello di carcinoma mammario MDA-MB-231 o nel modello di carcinoma del colon DLD-1. Si osserva una significativa riduzione dose-dipendente delle cellule endoteliali CD31-positive a 12,5 mg/kg/die, 25 mg/kg/die e 50 mg/kg/die nei tumori GTL-16, indicando che l'inibizione della MVD mostra una correlazione dose-dipendente con l'efficacia antitumorale. PF-2341066 mostra una significativa riduzione dose-dipendente dei livelli plasmatici umani di VEGFA e IL-8 in entrambi i modelli GTL-16 e U87MG. Si osserva una marcata inibizione dei livelli fosforilati di c-Met, Akt, Erk, PLCλ1 e STAT5 nei tumori GTL-16 in seguito a somministrazione p.o. di PF-2341066.[4]

• Saggi ELISA di fosforilazione di chinasi cellulari

  Le cellule vengono seminate in piastre a 96 pozzetti in terreni supplementati con 10% di siero fetale bovino (FBS) e trasferite in terreni privi di siero [con 0,04% di albumina di siero bovino (BSA)] dopo 24 ore. Negli esperimenti che indagano la fosforilazione delle RTK dipendente dal ligando, vengono aggiunti i fattori di crescita corrispondenti per un massimo di 20 minuti. Dopo l'incubazione delle cellule con PF-2341066 per 1 ora e/o ligandi appropriati per i tempi designati, le cellule vengono lavate una volta con HBSS supplementato con 1 mM di Na₃VO₄ e i lisati proteici vengono generati dalle cellule. Successivamente, la fosforilazione delle Protein Tyrosine Kinase selezionate viene valutata mediante un metodo ELISA a sandwich utilizzando anticorpi di cattura specifici utilizzati per rivestire piastre a 96 pozzetti e un anticorpo di rilevazione specifico per i residui di tirosina fosforilati. Le piastre rivestite con anticorpi vengono (a) incubate in presenza di lisati proteici a 4°C per una notte; (b) lavate sette volte in PBS contenente 1% di Tween 20; (c) incubate in un anticorpo anti-fosfotirosina totale (PY-20) coniugato con perossidasi di rafano (1:500) per 30 minuti; (d) lavate nuovamente sette volte; (e) incubate in substrato di perossidasi 3,3′,5,5′-tetrametil benzidina per avviare una reazione colorimetrica che viene arrestata aggiungendo 0,09 N H₂SO₄; e (f) misurate per l'assorbanza a 450 nm utilizzando uno spettrofotometro.

• Linee cellulari

  GTL-16 gastric carcinoma cells and T47D breast carcinoma cells

• Concentrazioni

  0-256 nM

• Tempo di incubazione

  1 h

• Metodo

  Cells including GTL-16 gastric carcinoma cells and T47D breast carcinoma cells are seeded in 96-well plates in media supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and transferred to serum-free media [with 0.04% bovine serum albumin (BSA)] after 24 hours. In experiments investigating ligand-dependent RTK phosphorylation, corresponding growth factors are added for up to 20 minutes. After incubation of cells with PF-2341066 for 1 hour and/or appropriate ligands for the designated times, cells are washed once with HBSS supplemented with 1 mM Na₃VO₄, and protein lysates are generated from cells. Subsequently, phosphorylation of selected protein kinases is assessed by a sandwich ELISA method using specific capture antibodies used to coat 96-well plates and a detection antibody specific for phosphorylated tyrosine residues. Antibody-coated plates are (a) incubated in the presence of protein lysates at 4 °C overnight; (b) washed seven times in 1% Tween 20 in PBS; (c) incubated in a horseradish peroxidase–conjugated anti–total-phosphotyrosine (PY-20) antibody (1:500) for 30 min; (d) washed seven times again; (e) incubated in 3,3^′,5,5^′-tetramethyl benzidine peroxidase substrate to initiate a colorimetric reaction that is stopped by adding 0.09 N H₂SO₄; and (f) measured for absorbance in 450 nm using a spectrophotometer.

• Modelli animali

  Female or male nu/nu mice bearing NCI-H441,or DLD-1, or MDA-MB-231

• Dosaggi

  12.5 mg/kg/day, 25 mg/kg/day, and 50 mg/kg/day

• Somministrazione

  p.o.