CP-673451

CP 673451 è un inibitore selettivo di PDGFRα/β con IC50 di 10 nM/1 nM, mostra una selettività >450 volte superiore rispetto ad altri recettori angiogenici. Nei tumori di glioblastoma, questo composto (33 mg/kg) fornisce un'inibizione >50% del recettore PDGFR-β per 4 ore, corrispondente a un EC50 di 120 ng/mL nel plasma al C_max. In un modello di angiogenesi a spugna, questo inibitore inibisce il 70% dell'angiogenesi stimolata da PDGF-BB a una dose di 3 mg/kg (q.d. ×5, p.o., corrispondente a 5,5 ng/mL al C_max).[1] Questa sostanza chimica diminuisce il tasso di proliferazione cellulare attraverso meccanismi che coinvolgono la ridotta fosforilazione di GSK-3α e GSK-3β. In entrambe le colture RD e RUCH2, compromette la capacità di formazione di rabdosfere e la differenziazione cellulare, causando un aumento della senescenza. [2]

CP 673451 (dosaggio p.o. una volta al giorno ?0 giorni di routine) inibisce la crescita tumorale (ED50 < 33 mg/kg) in numerosi xenotrapianti tumorali umani cresciuti s.c. in topi atimici, inclusi il carcinoma polmonare umano H460, i carcinomi del colon umano Colo205 e LS174T e il glioblastoma multiforme umano U87MG. [1] Nei topi portatori di xenotrapianti RUCH2, questo composto riduce la crescita tumorale e l'infiltrazione delle cellule stromali. [2]

• Saggio di inibizione della chinasi

  Un costrutto del dominio chinasico marcato con glutatione S-transferasi della porzione intracellulare del PDGFR-β (aminoacidi 693-1401, numero di accesso J03278) è espresso in cellule Sf-9 (sistema di espressione baculovirale). La cinetica enzimatica è determinata incubando l'enzima con concentrazioni crescenti di ATP in tampone di fosforilazione [50 mmol/L HEPES (pH 7,3), 125 mmol/L NaCl, 24 mmol/L MgCl₂ in piastre Nunc Immuno MaxiSorp a 96 pozzetti precedentemente rivestite con 100 μL di 100 μg/mL di poli-Glu-Tyr (rapporto 4:1) diluito in PBS. Dopo 10 minuti, le piastre vengono lavate (PBS, 0,1% Tween 20), incubate con anticorpo anti-fosfotirosina-perossidasi di rafano e diluite in PBS, 0,05% Tween 20, 3% BSA per 30 minuti a temperatura ambiente. Le piastre vengono lavate come sopra e incubate con 3,3

• Linee cellulari

  PAE

• Concentrazioni

  ~3000 nM

• Tempo di incubazione

  18 min

• Metodo

  PAE cells stably expressing full-length PDGFR and VEGFR have been generated. For cell-based selectivity assays, PAE cells are transfected with fulllength human PDGFR-a, PDGFR-h, or VEGFR-2. Cells are seeded at 4×10⁵ cells/mL in 50 μL growth medium (Ham's F-12 media supplemented with 10% fetal bovine serum, 50,000 units each penicillin and streptomycin. After 6 to 8 hours, the growth medium is replaced with 50 μL serum-depleted medium (as above, but with 0.1% fetal bovine serum) and cells are incubated overnight. Immediately before compound addition, the medium was replaced with 95 μL serum-depleted medium. Compounds are diluted in 100% DMSO, added to the cells at a final DMSO concentration of 0.25% v/v, and incubated at 37°C for 10 minutes. Cells are stimulated with the appropriate ligand and incubated as above for an additional 8 minutes. The medium is removed and the cells washed once with PBS, then lysed with 50 μL HNTG buffer [20 mmol/L HEPES (pH 7.5), 150 mmol/L NaCl, 2% Triton X-100, 10% glycerol, 5 μmol/L EDTA, 2 mmol/L NaVO₄, and 1 EDTA-free complete protease inhibitor tablet per 25 mL] for 5 minutes at room temperature. Lysates are then diluted with 50 μL HG buffer [20 mmol/L HEPES (pH 7.5), 10% glycerol]. The diluted cell lysates are mixed thoroughly, 50 μL of supernatant are transferred to the ELISA capture plate, and incubated at room temperature for 2 hours with agitation. ELISA capture plates are prepared by coating 96-well ReactiBind goat-antirabbit plates with 100 μL/well of 5 μg/mL rabbit anti-human PDGFR-h, anti-PDGFR-a, or anti-VEGFR-2 antibody for 60 to 90 minutes. At the end of the 2-hour incubation the plates are washed (PBS, 0.1% Tween 20) before incubation with anti-phosphotyrosine-horseradish peroxidase antibody (diluted in PBS, 0.05% Tween 20) for 30 minutes at room temperature. The plates are washed again, then incubated with tetramethylbenzidine and evaluated as described above. IC50 values are calculated as percent inhibition of control.

• Modelli animali

  Athymic female mice

• Dosaggi

  3, 10, or 33 mg/kg

• Somministrazione

  Oral gavage