CHIR-124

CHIR-124 è una piccola molecola a base di chinolone strutturalmente non correlata ad altri inibitori noti di Chk1. Questo composto interagisce sinergicamente con i veleni della topoisomerasi (ad esempio, Camptotecina o SN-38) nel causare l'inibizione della crescita in una varietà di linee cellulari tumorali, inclusi il carcinoma mammario (MDA-MB-231 e MDA-MB-435) e il carcinoma del colon (SW-620 e Colo205), tutte contenenti il gene p53 mutato. Esso abroga i Cell Cycle Checkpoints S e G2-M indotti da SN-38 e potenzia l'apoptosi nelle cellule di cancro al seno MDA-MD-435. L'abrogazione del Cell Cycle Checkpoint G2-M e l'induzione dell'apoptosi da parte di questa sostanza chimica sono aumentate dalla perdita di p53. [1] Questo composto mira potentemente anche ad altre chinasi come PDGFR e Flt3 con IC50 di 6,6 nM e 5,8 nM, rispettivamente. [2]

CHIR-124 potenzia gli effetti inibitori della crescita abrogando il Cell Cycle Checkpoint G₂-M e aumentando l'apoptosi tumorale in un modello di xenotrapianto ortotopico di cancro al seno.

• Chk1 Assay

  Per il saggio Chk1, il dominio chinasico è espresso in cellule di insetto Sf9 e un peptide cdc25c biotinilato contenente il sito di fosforilazione consenso Chk1/Chk2 (*) (biotin-[AHX]SGSGS*GLYRSPSMP-ENLNRPR[CONH2]) è usato come substrato. Una serie di diluizioni di CHIR-124 viene miscelata con un tampone di reazione chinasica contenente una concentrazione finale di 30 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl₂, 2 mM DTT, 4 mM EDTA, 25 mM β-glicerofosfato, 5 mM MnCl₂, 0,01% di albumina sierica bovina, 1,35 nM di dominio chinasico CHK1, 0,5 μM di substrato peptidico e 1 AM di ATP non marcato, più 5 nM di ATP marcato con ³³Pγ (attività specifica = 2.000 Ci/mmol). Le reazioni e la rilevazione del trasferimento di fosfato sono eseguite con un metodo radioattivo. Le reazioni sono incubate a temperatura ambiente per 1-4 ore e il peptide fosforilato è catturato su piastre a micropozetti rivestite di streptavidina contenenti tampone di arresto della reazione (25 mM EDTA [acido etilendiamminotetraacetico], 50 mM HEPES, pH 7,5). Il peptide fosforilato viene misurato con il sistema DELFIA TRF utilizzando un anticorpo anti-fosfotirosina PT66 marcato con Europio. La concentrazione di questo composto per l'IC50 viene calcolata utilizzando la regressione non lineare con il software di analisi dei dati XL-Fit.

• Linee cellulari

  MDA-MB-231, MDA-MB-435, SW-620, and COLO 205 cells

• Concentrazioni

  0-2350 nM, dependent on cell types

• Tempo di incubazione

  48 hours

• Metodo

  MDA-MB-231, MDA-MB-435, SW-620, and COLO 205 cells in log-phase are plated into 96-well microplates. CHIR-124 is serially diluted in the presence of six different concentrations of Camptothecin or 0 nM camptothecin. Camptothecin is also serially diluted in the absence of this compound. This chemical is added to cells in 96-well dishes and incubated at 37 °C for 48 hours. Each treatment condition is done in triplicate. Cell proliferation is monitored by the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5- (3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium (MTS), inner salt assay. MTS inner salt is added to the microplates, which are incubated for another 3 hours, and absorbance at 490 nm is read on a plate reader. The concentrations of each drug in the combinations required to produce 50% inhibition are plotted to generate the isoboles. Isobologram analysis of drug interaction is based the equation of Loewe additivity (1= D _A /IC50, _A + D_B/IC50, _B), where IC50, _A and IC50, _B are the concentrations of drugs to result in 50% inhibition for each drug alone, and D_A and D_B are concentrations of each drug in the combination that yield 50% overall inhibition. A diagonal line indicating Loewe additivity is included in each graph. Data points that fall below the line indicate synergy, whereas those that fall above the line will indicate antagonism

• Modelli animali

  MDA-MB-435 cells are implanted in the mammary fat pad of 8- to 10-week-old female immunodeficient mice.

• Dosaggi

  10 mg/kg or 20 mg/kg

• Somministrazione

  CHIR-124 is given orally four times daily × 6 on days 2 to 7 in captisol.