CFTRinh-172

CFTRinh-172 inibisce il trasporto di Cl^- mediato da CFTR in modo dose- e tempo-dipendente e inibisce efficacemente l'attivazione di CFTR da parte di più tipi di agonisti o attivatori. [1] Questo composto, come inibitore selettivo del canale CFTR, abolisce anche completamente la corrente di Cl⁻ nelle cellule acinari e duttali della ghiandola lacrimale di coniglio. [2] Induce anche la produzione di ROS, il fallimento mitocondriale e l'attivazione della via di segnalazione NF-κB, indipendentemente dall'inibizione di CFTR. [3]

CFTRinh-172 (20 µg/6 h) abolisce completamente la secrezione di liquido intestinale indotta da V. cholerae senza influenzare la crescita di V. cholerae in vivo. [4]

• Procedure di screening

  Gli esperimenti vengono eseguiti utilizzando un sistema di screening personalizzato costituito da un braccio robotico di 3 metri, un incubatore a CO₂, un lavapiastre, una workstation per la manipolazione di liquidi, un lettore di codici a barre, una stazione di rimozione del coperchio e due lettori di piastre a fluorescenza FLUOstar, ciascuno dotato di due pompe a siringa e filtri di eccitazione HQ500/20X (500 ± 10 nm) ed emissione HQ535/30M (535 ± 15 nm). Il sistema robotico è integrato utilizzando il software SAMI versione 3.3 modificato per due lettori di piastre. Un software personalizzato è scritto in Microsoft VBA (Visual Basic for Applications) per calcolare le pendenze di fluorescenza normalizzate e sottratte dalla linea di base (che danno i tassi di afflusso di alogenuri) dai file di dati memorizzati. L'esperimento è impostato caricando l'incubatore (37°C, 90% di umidità, 5% di CO₂) con 40-60 piastre a 96 pozzetti contenenti le cellule FRT, e caricando una giostra con piastre a 96 pozzetti contenenti i composti di prova e le punte di pipetta di plastica monouso. Per iniziare l'esperimento, ogni pozzetto di una piastra a 96 pozzetti viene lavato tre volte in PBS (300 μl/lavaggio), lasciando 50 μL di PBS. Vengono aggiunti dieci microlitri di un cocktail attivante CFTR (5 μM forskolina, 100 μM IBMX, 25 μM apigenina in PBS) e, dopo 5 minuti, un composto di prova (0,5 μL di una soluzione 1 mM di DMSO) viene aggiunto a ciascun pozzetto per dare una concentrazione finale di 10 μM. Dopo 10 minuti, le piastre a 96 pozzetti vengono trasferite a un lettore di piastre per l'esperimento di fluorescenza. Ogni pozzetto viene analizzato individualmente per il trasporto di I– mediato da CFTR registrando continuamente la fluorescenza (200 ms per punto) per 2 secondi (linea di base) e poi per 12 secondi dopo l'aggiunta rapida (<0,5 secondi) di 165 μL di PBS isosmolar in cui 137 mM di Cl– è stato sostituito da I–.

• Linee cellulari

  Fischer rat thyroid (FRT) cells

• Concentrazioni

  ~1 mM

• Tempo di incubazione

  24 hours

• Metodo

  Cell toxicity is assayed by the dihydrorhodamine method at 24 hours after cell incubation with 0–1,000 μM of this compound.

• Modelli animali

  An adult mouse model of Vibrio cholerae-induced diarrhea

• Dosaggi

  20 µg/6 h

• Somministrazione

  Intraperitoneal administration