CFSE

Preparazione della soluzione di lavoro di CFDA-SE
1.1 Preparazione della soluzione stock
Sciogliere 1 mg di CFDA-SE in 0,1794 mL di DMSO per ottenere 10 mM di CFSE.
Nota: Si raccomanda di conservare la soluzione stock a -20 ℃ o -80 ℃ al riparo dalla luce ed evitare cicli ripetitivi di congelamento-scongelamento.
1.2 Preparazione di questa soluzione di lavoro chimica
Diluire la soluzione stock in terreno di coltura cellulare privo di siero o PBS per ottenere 5-10 μM di questa soluzione di lavoro chimica.
Nota: Si prega di regolare la concentrazione di questa soluzione di lavoro chimica in base alla situazione reale.
Colorazione cellulare
2.1 Per le cellule in sospensione: Centrifugare a 1000 g a 4℃ per 3-5 minuti e quindi scartare il surnatante. Lavare due volte con PBS, 5 minuti ogni volta.
Per le cellule aderenti: Scartare il terreno di coltura cellulare e aggiungere tripsina per dissociare le cellule e formare una sospensione monocellulare. Centrifugare a 1000 g a 4℃ per 3-5 minuti e quindi scartare il surnatante. Lavare due volte con PBS, 5 minuti ogni volta.
2.2 Aggiungere 1 mL di questa soluzione di lavoro chimica, quindi incubare a temperatura ambiente per 30 minuti.
2.3 Centrifugare a 400 g a 4℃ per 3-4 minuti e quindi scartare il surnatante.
2.4 Lavare due volte con PBS, 5 minuti ogni volta.
2.5 Risospendere le cellule con terreno di coltura cellulare privo di siero o PBS, quindi rilevare con microscopio a fluorescenza o citometro a flusso.

La marcatura in vivo delle cellule con CFSE è fattibile praticamente senza alcun effetto tossico sulle cellule marcate o adiacenti. Presenta vantaggi in studi di migrazione a lungo termine, come dimostrato dal recupero di cellule T negli organi linfoidi periferici[2].

• Linee cellulari

  human erythroleukaemic cell line K562, mouse lymphoma cell line YAC-1, human mammary cancer cell line MCF-7 and human melanoma cell line A375

• Concentrazioni

  2 µM, 3 µM, 4 µM, 5 µM, 10 µM and 20 µM

• Tempo di incubazione

  5, 6, 7, 8, 10 and 15 min

• Metodo

  The 5 mM CFDA-SE stock in DMSO is diluted to different concentrations(2 µM, 3 µM, 4 µM, 5 µM, 10 µM and 20 µM) in PBS with a total volume of 1 ml. After each cell line is harvested and washed three times with PBS, 1×10⁹ cells are added to equal volume of this compound with different concentrations and incubated at 37°C for 5, 6, 7, 8, 10 and 15 min with agitation. The labeling reaction is stopped for 1 min by adding an equal volume of heat inactivated fetal bovine serum. The CFDA-SE labeled cells are washed twice with PBS and recounted, and the cell concentration is adjusted to 6×104cells/ml in IMDM containing 10% FCS.

• Modelli animali

  C57Bl/6 mice

• Dosaggi

  10 μM

• Somministrazione

  injected into thymic lobe