Delanzomib

CEP-18770 dimostra una prevenzione marginale delle attività triptica e peptidil-glutamilica del Proteasome.[1] CEP-18770 inibisce le cellule di cancro ovarico A2780, il cancro alla prostata PC3, l'H460, il cancro al colon LoVo, il cancro al mieloma multiplo RPMI8226 e il linfoma non Hodgkin anaplastico HS-Sultan con valori di IC50 di 13,7, 22,2, 34,2, 11,3, 5,6 e 8,2 nM, rispettivamente.[1] CEP-18770 blocca la via ubiquitina-Proteasome in diversi MM e nella linea cellulare di leucemia mieloide cronica, K562. CEP-18770 provoca un accumulo di proteine ubiquitinate nell'arco di 4-8 ore.[1] La degradazione di IκBα è completamente bloccata dal pretrattamento con CEP-18770. CEP-18770 inibisce significativamente alti livelli di attività NF-κB sia nelle cellule RPMI-8226 che U266. La soppressione dell'attività di legame al DNA di NF-kB, dipendente dal tempo e dalla concentrazione, nelle linee cellulari di MM da parte di CEP-18770 porta a una diminuzione dell'espressione di diversi geni modulati da NF-κB che mediano la crescita e la sopravvivenza delle cellule tumorali, inclusi IkBα stesso, la proteina inibitrice dell'apoptosi legata al cromosoma X (XIAP), le citochine pro-infiammatorie TNF-α e interleuchina-1β (IL-1β), la molecola di adesione intracellulare (ICAM1) e il fattore pro-angiogenico fattore di crescita endoteliale vascolare.[1] L'espressione di questi geni mediati da NF-κB è associata a una risposta clinica più favorevole a questo agente, evidenziandone il potenziale valore prognostico in risposta all'esposizione a CEP-18770.[1] L'attività proapoptotica di CEP-18770 contro il MM non è limitata solo alle linee cellulari di MM derivate da tumori, ma si estende agli espianti primari di MM da pazienti in ricaduta o refrattari.[1] Inoltre, CEP-18770 in combinazione produce un'inibizione sinergica della vitalità delle cellule MM in vitro.[2]

CEP-18770 rivela un'inibizione sostenuta, dose-correlata, del peso relativo del tumore. CEP-18770 porta a regressioni tumorali complete dose-correlate, che si traducono in un'incidenza del 50% di CR alla sua dose massima tollerata (MTD) di 1,2 mg/kg per via endovenosa. [1] CEP-18770 rivela un aumento dose-correlato nell'incidenza di topi liberi da tumore al completamento di questi studi (120 giorni dopo il trapianto tumorale). La somministrazione orale di CEP-18770 produce una marcata diminuzione del peso del tumore e una notevole incidenza dose-correlata di regressione tumorale completa con minime alterazioni del peso corporeo degli animali nel corso degli studi di 120 giorni. [1]_EDosi equiactive di CEP-18770 rivelano un'inibizione maggiore e più sostenuta, dose-correlata, dell'attività del Proteasome tumorale, corrispondente temporalmente alla massima induzione dell'attività di caspasi-3 e 7.[1] Il segnale apoptotico massimo è 2,5 volte maggiore per CEP-18770. Al contrario, i profili di inibizione del Proteasome di CEP-18870 sono comparabili nei normali tessuti periferici di topo esaminati (fegato, polmoni, sangue intero e cervello [nessuna attività]) sia nella loro magnitudine che nella loro durata.[1] Nessuna inibizione del Proteasome viene rilevata nel tessuto cerebrale in nessun momento per CEP-18770 o. [1] Il singolo agente CEP-18770 PO mostra anche marcati effetti anti-MM in questi modelli di xenotrapianto.[1]

• Indagine sull'attività del Proteasome negli estratti cellulari

  Le cellule umane di mieloma multiplo vengono lavate due volte con soluzione salina tamponata con fosfato fredda, centrifugate e lisate con un volume di perle di vetro (<106 micron, lavate con acido) e un volume uguale di tampone di omogeneizzazione (50 mM Tris (pH 7,4), 1 mM ditiotreitolo, 5 mM MgCl₂, 2 mM ATP e 250 mM saccarosio) mediante vortex a velocità elevata per 15-30 minuti a 4 °C. Perle, frazioni di membrana, nuclei e detriti cellulari vengono quindi rimossi dal surnatante mediante centrifugazione a 16.000 g per 5 minuti. Il contenuto proteico degli estratti viene quantificato utilizzando il saggio di Bradford. L'attività del Proteasome viene saggiata come descritto di seguito. Uguali quantità (tipicamente 60 g) di proteina vengono denaturate bollendo in tampone di campionamento riducente, separate mediante SDS-PAGE al 12,5% ed elettrotrasferite su membrane di difluoruro di polivinilidene (PVDF). L'immunoblotting viene eseguito utilizzando un anticorpo policlonale dansil-sulfonamidohexanoil (1:7.500, coniglio) e un anticorpo secondario di capra o suino anti-coniglio accoppiato alla perossidasi di rafano, seguito da chemiluminescenza potenziata.

• Linee cellulari

  HMEC and TEC cells

• Concentrazioni

  0-100 nM

• Tempo di incubazione

  6 hours

• Metodo

  HMEC and TEC cells are seeded into 24-well plates at a density of 10⁴ cells/well in DMEM supplemented with 5% FCS. After incubation with proteasome inhibitors (48 hours), cells are washed, air dried, and stained with crystal violet as described. Cell number is determined, in duplicate samples, on the basis of a standard curve obtained with known cell numbers. All experiments are performed in triplicate. In vitro formation of capillary-like structures is studied on cells (4 × 10⁴ cells/well in DMEM supplemented with 5% FCS. After incubation with proteasome inhibitors (48 hours), cells are washed (cells/well in 24-well plates) and seeded onto Matrigel-coated wells in DMEM containing 0.25% BSA. HMEC and TEC cells (5 × 10³ per well), suspended in 200 μL DMEM with 5% FCS (positive control), serum-free medium (negative control), are layered onto the Matrigel surface in the presence or absence of proteasome inhibitor CEP-18770. Cells are observed with a microscope and experimental results are then recorded after a 6-hour incubation at 37 °C. Data is analyzed, as the mean (× 1 SD) of total length of capillary-like structures, by the Micro-Image system and is expressed as mm/field by the computer analysis system in 5 different fields at 100 × magnification in duplicated wells for 4 different experiments.

• Modelli animali

  Human MM RPMI 8226 subcutaneous xenograft model in SCID mice

• Dosaggi

  From 1.5 to 4 mg/kg, twice for 7 days to 4 weeks.

• Somministrazione

  Intravenously