PR-171 (Carfilzomib)

Il Carfilzomib (PR-171) inibisce la proliferazione in una varietà di linee cellulari e cellule neoplastiche derivate da pazienti, incluso il mieloma multiplo, e ha indotto percorsi di segnalazione apoptotici intrinseci ed estrinseci e l'attivazione della chinasi c-Jun-N-terminale (JNK). Rivela un'attività anti-MM migliorata, supera la resistenza ad altri agenti e agisce sinergicamente con (Dex). Questo composto mostra una potenza inibitoria in vitro preferenziale contro l'attività ChT-L nella subunità β5, con oltre l'80% di inibizione a dosi di 10 nM. Una breve esposizione a basse dosi di Carfilzomib porta a una specificità di legame preferenziale per il Proteasome costitutivo 20S β5 e le subunità dell'immunoproteasoma β5i. La misurazione dell'attività delle caspasi nelle cellule ANBL-6 pulsate con esso rivela aumenti sostanziali dell'attività delle caspasi-8, caspasi-9 e caspasi-3 dopo 8 ore, dando un aumento di 3,2, 3,9 e 6,9 volte, rispettivamente, rispetto alle cellule di controllo dopo 8 ore. Nelle cellule trattate con Carfilzomib pulsato, l'integrità della membrana mitocondriale è diminuita al 41% (Q1 + Q2), rispetto al 75% nelle cellule di controllo trattate con veicolo. [1] In un altro studio, ha anche mostrato efficacia preclinica contro le malignità ematologiche e solide. [2] Inibisce direttamente la formazione degli osteoclasti e il riassorbimento osseo. [3]

Il Carfilzomib (PR-171) riduce moderatamente la crescita tumorale in un modello di xenotrapianto in vivo. Diminuisce efficacemente la vitalità delle cellule del mieloma multiplo a seguito di un trattamento continuo o transitorio. Questo composto aumenta anche il volume osseo trabecolare, diminuisce il riassorbimento osseo e migliora la formazione ossea in topi non portatori di tumore. [3]

• Saggio immunoenzimatico per la profilazione delle subunità del Carfilzomib

  Le cellule ANBL-6 (2 × 10⁶/pozzetto) vengono piastrate in piastre a 96 pozzetti e trattate con Carfilzomib (PR-171) a dosi da 0,001 a 10 μM per 1 ora. Le cellule vengono quindi lisate (20 mM Tris-HCl, 0,5 mM EDTA) e i lisati chiarificati vengono trasferiti in piastre per reazione a catena della polimerasi (PCR). Viene generata una curva standard utilizzando lisati di cellule ANBL-6 non trattate, a partire da una concentrazione di 6 μg di proteine/μL. La sonda del sito attivo [biotina-(CH2)4-Leu-Leu-Leu-epossichetone; 20 μM] viene aggiunta e incubata a temperatura ambiente per 1 ora. I lisati cellulari vengono quindi denaturati aggiungendo l'1% di dodecil solfato di sodio (SDS) e riscaldando a 100°C, seguiti dalla miscelazione con 20 μL per pozzetto di perle ad alte prestazioni di streptavidina-sefarosio in una piastra multiscreen DV a 96 pozzetti e incubati per 1 ora. Queste perle vengono quindi lavate con tampone di saggio immunoenzimatico (ELISA) (PBS, 1% di albumina sierica bovina e 0,1% di Tween-20) e incubate durante la notte a 4°C su uno shaker per piastre con anticorpi contro le subunità del Proteasome. Gli anticorpi utilizzati includevano anticorpi monoclonali di topo anti-β1, anti-β2, anti-β1i e anti-β5i, anticorpi policlonali di capra anti-β2i e anticorpi policlonali di coniglio anti-β5 (antisiero purificato per affinità contro il peptide KLH-CWIRVSSDNVADLHDKYS). Le perle vengono lavate e incubate per 2 ore con anticorpi secondari coniugati con perossidasi di rafano di capra anti-coniglio, capra anti-topo o coniglio anti-capra. Dopo il lavaggio, le perle vengono sviluppate utilizzando il substrato di picochemiluminescenza Supersignal ELISA. Viene eseguita la rilevazione luminescente. La luminescenza grezza viene convertita in μg/mL per confronto con la curva standard ed espressa come % di inibizione rispetto al controllo del veicolo. Le curve di adattamento vengono generate utilizzando la seguente equazione dose-risposta non sigmoide: Y = Fondo + (Top-Fondo)/(1 + 10̂((LogEC50 − X) × HillSlope)), dove X è il logaritmo della concentrazione, Y è la % di inibizione ed EC50 è la dose di questo composto che mostra il 50% di effetto.

• Linee cellulari

  WST-1, ANBL-6 cells

• Concentrazioni

  100 nM

• Tempo di incubazione

  1 hour

• Metodo

  WST-1 is used to determine the effects of Carfilzomib (PR-171), a proteasome inhibitor, on cell proliferation. The inhibition of proliferation is calculated in relation to parallel control cells that receives vehicle alone. A linear spline function is used to interpolate the median inhibitory concentration (IC50) using XLfit 4 software. The degree of resistance (DOR) is calculated using the formula: DOR = IC50(resistant cells)/IC50(sensitive cells). ANBL-6 cells pulsed with 100 nM of this compound are washed and suspended in PBS containing 5 μg/mL of JC-1, which exhibits potential-dependent accumulation in mitochondria. Analysis of the mitochondrial membrane potential-dependent color shift from 525 to 590 nm is carried out on a FacScan, and the data are analyzed with CellQuest software.

• Modelli animali

  Beige-nude-XID mice

• Dosaggi

  2.0 mg/kg

• Somministrazione

  i.v.