BRD4770

I saggi immuno-fluorimetrici a lantanidi con dissociazione potenziata (DELFIA) vengono eseguiti in piastre a 384 pozzetti bianche e opache rivestite con Neutravidin. I composti testati vengono diluiti a 12 μg/mL in 50mM Tris-HCl pH 8,5 contenente 4% di DMSO e 10 μL vengono dispensati nei pozzetti. I pozzetti vuoti e di controllo hanno ricevuto solo il tampone del composto. GST-G9a a 10 μg/mL e SAM a 40 μM vengono diluiti in 50mM Tris HCl pH 8,5/10 mM DTT e aggiunti in un volume di 20 μL. I pozzetti vuoti ricevono solo tampone Tris/DTT. Le reazioni vengono avviate con l'aggiunta di 800 nM di substrato H3(1-20)-cysbiotin in 50 mM Tris pH 8,5 in un volume di 10 μL, e incubate a temperatura ambiente per 60 minuti. Le piastre vengono lavate 3 volte con 100 μL di tampone di lavaggio (50mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,05% Tween 20, 0,2% BSA). Successivamente, 50 μL di tampone Fluoroimmunoassay (FI) (50 mM Tris HCl pH 7,8, 150 mM NaCl, 0,05% Tween 40, 25 μM DTPA, 0,2% BSA, 0,05% BGG) contenente 5ng di α-2X-di-meth H3-K9 e 5ng di chelato di Eu anti-coniglio di capra vengono aggiunti a tutti i pozzetti della piastra, e la piastra viene incubata per un'ulteriore ora a temperatura ambiente. Le piastre vengono lavate 3 volte con 100 μL di tampone di lavaggio, e 50 μL di soluzione di miglioramento vengono aggiunti a ciascun pozzetto. La fluorescenza risolta nel tempo viene misurata dopo 45 minuti su un Viewlux Microplate Imager, con imaging per 15 secondi con una finestra di 354 μs, un ritardo di 400 μs, eccitazione a 360 nm ed emissione a 618 nm.

PANC-1 cells

~20 μM

72 hours

PANC-1 cells are seeded and treated with BRD4770 in 6-well plates for 72 h. Cells are trypsinized and tested for soft agar colony formation using CytoSelect 96-Well Cell Transformation Assay, using the CyQuant GR dye to measure total cellular nucleic acid levels. Fluorescence is detected with an Analyst HT plate reader using a 485/520 nm filter set.