BIO-acetoxime

Le attività delle chinasi vengono saggiate nel tampone A o C, a 30 °C, a una concentrazione finale di ATP di 15 μM. I valori di bianco vengono sottratti e le attività calcolate come pmoli di fosfato incorporato per un'incubazione di 10 minuti. Le attività sono espresse in % dell'attività massima, cioè in assenza di inibitori. I controlli vengono eseguiti con diluizioni appropriate di DMSO. La GSK-3α/β viene purificata da cervello suino mediante cromatografia di affinità su assina immobilizzata. Viene saggiata, dopo una diluizione 1/100 in 1 mg BSA/mL 10 mM DTT, con 5 μL di 40 μM di peptide GS-1 come substrato, nel tampone A, in presenza di 15 μM di [γ-³³P] ATP (3000 Ci/mmol; 1 mCi/mL) in un volume finale di 30 μL. Dopo 30 minuti di incubazione a 30 °C, aliquote di 25 μL del surnatante vengono deposte su pezzi di carta di fosfocellulosa Whatman P81 da 2,5 × 3 cm e, 20 secondi dopo, i filtri vengono lavati cinque volte (per almeno 5 minuti ogni volta) in una soluzione di 10 mL di acido fosforico/litro di acqua. I filtri bagnati vengono contati in presenza di 1 mL di liquido scintillante ACS. CDK1/ciclina B viene estratta in tampone di omogeneizzazione da ovociti di stella marina (Marthasterias glacialis) in fase M e purificata mediante cromatografia di affinità su perle di sefarosio p9CKShs1, da cui viene eluita da p9CKShs1 libero. L'attività chinasica viene saggiata nel tampone C, con 1 mg di istone H1 /mL, in presenza di 15 μM di [γ-³²P] ATP (3000 Ci/mmol; 1 mCi/mL) in un volume finale di 30 μL. Dopo 10 minuti di incubazione a 30 °C, aliquote di 25 μL del surnatante vengono deposte su carte di fosfocellulosa P81 e trattate come descritto sopra. CDK5/p25 viene ricostituita mescolando quantità uguali di CDK5 e p25 mammiferi ricombinanti espressi in E. coli come proteine di fusione GST (Glutathione-S-transferase) e purificati mediante cromatografia di affinità su glutatione-agarosio (p25 è una versione troncata di p35, l'attivatore di CDK5 da 35 kDa). La sua attività viene saggiata nel tampone C come descritto per CDK1/ciclina B.0

KCN, KCNR, SY5Y, Kelly, and IMR32 cells

~1 μM

72 h

Cell viability is analyzed by CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay according to manufacturer's instructions, approximately 5,000 cells are plated per well of 96-well tissue culture plates with 100 μL of medium. To assess cell viability, rather than proliferation rate, inhibitor- and control-treated cells are assayed after the same growth time had elapsed. The results represent the mean ± SD of triplicate samples, expressed as a percentage of control.