BI 2536

BI 2536 blocca le attività di Plk2 e Plk3 in misura leggermente minore con IC50 rispettivamente di 3,5 nM e 9,0 nM. Nelle cellule HeLa, il trattamento con questo composto in un intervallo di 10-100 nM porta al blocco del reclutamento della γ-tubulina e della fosforilazione di Apc6 nei centrosomi mitotici, all'inibizione del rilascio della coesina dai bracci cromosomici, all'induzione di fusi monopolari, nonché a una serie di altri processi mitotici noti per dipendere da Plk1. Questo trattamento chimico porta le cellule HeLa ad arrestarsi in G2/M, successivamente a un picco di DNA sub-G1 indicativo di degradazione del DNA e apoptosi, e all'accumulo di frammenti di PARP p85 clivati in modo concentrazione-dipendente. Inibisce la crescita di un pannello di 32 linee cellulari tumorali umane con EC50 di 2-25 nM, bloccando al contempo la proliferazione di cellule hTERT-RPE1 in crescita esponenziale, cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC) e cellule renali di ratto normali (NRK) con EC50 di 12-31 nM. [1] L'inibizione di Plk1 da parte di questo composto riduce la crescita e la vitalità delle cellule di carcinoma tiroideo anaplastico (ATC) come CAL62, OCUT-1, SW1736, 8505C e ACT-1 con valori di EC50 di 1,4-5,6 nM. [2]

Il BI 2536 somministrato i.v. una o due volte a settimana è altamente efficace in diversi modelli di xenotrapianto con tollerabilità accettabile, inibendo la proliferazione cellulare attraverso un arresto mitotico e, successivamente, inducendo la morte delle cellule tumorali. La somministrazione di questo composto a 50 mg/kg una o due volte a settimana inibisce significativamente la crescita degli xenotrapianti HCT 116 con T/C del 15% e 0,3% rispettivamente. Questo trattamento chimico due volte a settimana porta anche a un'eccellente crescita tumorale nei modelli BxPC-3 e A549 con T/C del 5% e 14% rispettivamente. [1]

• Saggio chinasi Plk1 in vitro

  La Plk1 umana ricombinante (residui 1-603) è espressa come proteina di fusione N-terminale, con tag GST, utilizzando un sistema di espressione baculovirale e purificata mediante cromatografia di affinità con glutatione-agarosio. I saggi di attività enzimatica per Plk1 sono eseguiti in presenza di BI 2536 diluito in serie con 20 ng di chinasi ricombinante e 10 μg di caseina da latte bovino come substrato. Le reazioni chinasiche sono eseguite in un volume finale di 60 μL per 45 minuti a 30 °C (15 mM MgCl₂, 25 mM MOPS [pH 7,0], 1 mM DTT, 1% DMSO, 7,5 mM ATP, 0,3 μCi γ-³³P-ATP). Le reazioni sono terminate mediante l'aggiunta di 125 μL di TCA al 5% ghiacciato. Dopo il trasferimento dei precipitati su piastre filtranti Multi-Screen in estere di cellulosa misto, le piastre vengono lavate con TCA all'1% e quantificate radiometricamente. La curva dose-risposta viene utilizzata per calcolare il valore di IC50.

• Linee cellulari

  HeLa, A43, SKOV-3, HT-29, K562, A549, Saos-2, MCF7, HCT116, COLO 205, Hep G2, Raji and PC-3 cells, etc.

• Concentrazioni

  Dissolved in DMSO, final concentrations ~1 μM

• Tempo di incubazione

  24 and 72 hours

• Metodo

  Cells are exposed to various concentrations of BI 2536 for 24, and 72 hours. Cell growth is assessed by the measurement of Alamar Blue dye conversion in a fluorescence spectrophotometer. For determining the DNA content of the cultures, cell suspensions are fixed in 80% ethanol, treated for 5 minutes with 0.25% Triton X-100 in PBS, and incubated with 0.1% RNase and 10 μg/mL propidium iodide (PI) in PBS for 20 minutes at RT. Cell-cycle profiles are determined by flow cytometric analysis.

• Modelli animali

  Female BomTac:NMRI-Foxn1^nu mice injected subcutaneously with HCT 116, NCI-H460, or A549 cells

• Dosaggi

  ~50 mg/kg

• Somministrazione

  Injection i.v. once or twice per week