Bafilomycin A1 (Baf-A1)

Il terreno del saggio enzimatico dell'ATPase contiene 6 mM di MgSO₄, 50 mM di HEPES (pH 7.4), 200 mM di Na₂SO₃ (attivatore della V-ATPase), 0.5 mM di orto-vanadato di sodio (inibitore della P-ATPase), 0.5 mM di azide di sodio (inibitore della F-ATPase) e 3 mM di Na₂ATP. Questo terreno (1.0 mL), con o senza l'aggiunta dell'inibitore della V-ATPase Bafilomycin A1 (Baf-A1), viene incubato con l'omogenato filtrato (0.1 mL) per 60 minuti a 23–25 °C. La reazione viene arrestata con l'aggiunta di 1 mL di TCA al 3%. I bianchi spettrometrici sono preparati come per il saggio enzimatico, con l'eccezione che il campione di tessuto viene aggiunto dopo l'acido. L'analisi del fosfato viene eseguita aggiungendo 2 mL di 1-butanolo e 0.2 mL di soluzione di molibdato (5 g di molibdato di ammonio, 22 mL di H₂SO₄ a 100 mL). Dopo aver vorticato per 15 secondi, la soluzione viene neutralizzata con 0.5 mL di soluzione di citrato (100 g/500 mL, pH 7.0) e nuovamente vorticata per 15 secondi. La soluzione viene quindi centrifugata (2000 × g; 3 minuti) per separare la fase butanolica e l'assorbanza di questa fase viene letta a 400 nm. Vengono preparati standard di ortofosfato (0.1 μM–2.0 μM) e trattati allo stesso modo dei saggi di attività enzimatica. L'attività enzimatica è espressa in μmol di ortofosfato liberato per ora e per milligrammo di proteina. L'attività V-ATPase è considerata la differenza tra l'attività ATPasi totale misurata in presenza di Na₂SO₃, ortovanadato di sodio e azide di sodio e l'attività ATPasi misurata in presenza di questi reagenti e di questo composto.

HeLa cells

~20 nM

20 hours

H. pylori bacteria extract is treated with inhibitors, before addition to HeLa cells, as follows: DCCD 10 mM for 1 hour at 30 ºC; NBD-CI 100 μM for 1 hour at 30 ºC and the reaction is blocked with glycine 10 mM final concentration; NEM 275 μM for 1 hour at 30 ºC and the reaction is blocked by addition of β-mercaptoethanol 275 mM; Mg-ATP 14 μM for 1 hour at 0 ºC; 100 μM KNO₃ and 14 μM Mg-ATP for 1 hour at 30 μM; NaCO₃ 100 μM, pH 11 for 1 hour at 0 ºC. The bacterial extract is then added to cell with a 40-fold dilution at a final concentration of 0.65 mg/mL. Controls are HeLa cells incubated with untreated bacterial extracts and cells treated with Bafilomycin A1 (Baf-A1) under the same conditions as bacterial extracts, at the same concentrations or after a 40-fold dilution. The vacuotating activity of the bacterial extracts is assayed.

Young (approximately 9 days old) Mozambique tilapia, Oreochromis mossambicus

10 μM

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