Tivantinib

È stato dimostrato che ARQ-197 previene le risposte cellulari indotte da HGF/c-met in vitro. Questo composto possiede attività antitumorale; inibisce la proliferazione delle cellule A549, DBTRG e NCI-H441 con una IC50 di 0,38, 0,45, 0,29 μM. Il trattamento con questo agente porta a una diminuzione della fosforilazione della cascata di segnalazione MAPK e alla prevenzione dell'invasione e della migrazione. Inoltre, l'espressione ectopica di c-Met in NCI-H661, una linea cellulare senza espressione endogena di c-Met, la porta ad acquisire un fenotipo invasivo che viene anche soppresso da questa sostanza chimica. Sebbene l'aggiunta di concentrazioni crescenti di questo inibitore non influenzi significativamente il K_m dell'ATP, l'esposizione di c-Met a 0,5 μM di questa sostanza ha diminuito la V_max di c-Met di circa 3 volte. La capacità di questa molecola di diminuire la V_max senza influenzare il Km dell'ATP ha confermato che inibisce c-Met attraverso un meccanismo non-ATP-competitivo e può quindi spiegare il suo alto grado di selettività della chinasi. Previene il c-Met ricombinante umano con una costante inibitoria calcolata K_i di circa 355 nM. Sebbene la concentrazione più alta di ATP utilizzata sia di 200 μM, la potenza di questo composto contro c-Met non è ridotta utilizzando concentrazioni di ATP fino a 1 mM. Blocca la fosforilazione di c-Met e le vie di segnalazione a valle di c-Met. Questa sostanza chimica sopprime l'autofosforilazione costitutiva e mediata da ligandi di c-Met e, per estensione, l'attività di c-Met, portando a sua volta all'inibizione degli effettori a valle di c-Met. La sua induzione dell'apoptosi dipendente dalle caspasi è aumentata nelle cellule tumorali umane che esprimono c-Met, comprese le cellule HT29, MKN-45 e MDA-MB-231.[1][2]

Tutti e tre i modelli di xenotrapianto trattati con Tivantinib mostrano riduzioni della crescita tumorale: 66% nel modello HT29, 45% nel modello MKN-45 e 79% nel modello MDA-MB-231. In questi studi di xenotrapianto, non sono stati osservati cambiamenti significativi del peso corporeo dopo somministrazione orale di questo composto a 200 mg/kg. Farmacodinamicamente, la fosforilazione di c-Met nei tumori di xenotrapianto di colon umano (HT29) è fortemente inibita da questa sostanza chimica, come valutato da una drastica riduzione dell'autofosforilazione di c-Met 24 ore dopo una singola dose orale di 200 mg/kg di questo agente. Questa stessa dose nei topi mostra che gli xenotrapianti tumorali sono esposti a livelli plasmatici sostenuti del composto, coerenti con l'inibizione farmacodinamica osservata della fosforilazione di c-Met e l'inibizione della proliferazione delle linee cellulari tumorali che ospitano c-Met. I livelli plasmatici dell'agente 10 ore dopo la somministrazione sono determinati essere 1,3 μM, più di 3 volte superiori alla costante inibitoria biochimica di questa sostanza per c-Met. Pertanto, è in grado di sopprimere il suo bersaglio in vivo nel tessuto tumorale umano xenotrapiantato. In conclusione, questo inibitore blocca la crescita dei tumori umani xenotrapiantati dipendenti da c-Met.[1]

• Saggio chinasi in vitro SDS-PAGE di c-Met

  La proteina c-Met ricombinante (100 ng) viene preincubata con concentrazioni crescenti di questo composto per 30 minuti a temperatura ambiente. Dopo la preincubazione, 100 μM di substrato poli-Glu-Tyr e varie concentrazioni di ATP contenenti 5 μCi di [γ-32P]ATP vengono aggiunti alla miscela di reazione. La reazione viene incubata per 5 minuti a temperatura ambiente e quindi interrotta con l'aggiunta di 5 μL di gel di SDS-poliacrilammide, riducendo il tampone campione. I campioni vengono quindi caricati su un gel di acrilammide al 7,5% e viene eseguita l'SDS-PAGE. I substrati poli-Glu-Tyr fosforilati vengono infine visualizzati mediante autoradiografia. L'attività di c-Met viene quantificata mediante densitometria.

• Linee cellulari

  T29, MKN-45 and MDA-MB-231 cells

• Concentrazioni

  0.03-10 μM

• Tempo di incubazione

  24, 32, and 48 hours

• Metodo

  HT29, MKN-45, and MDA-MB-231 cells are seeded in black 96-well plates at 5 × 10³ cells per well overnight in a medium with 10% FBS. The next day, cells are treated with increasing concentrations of this compound (0.03-10 μM) for 24, 32, and 48 hours at 37 °C. After this compound treatment, the drug-containing medium is removed and cells are incubated for at least 10 minutes in a labeling solution (10 mM HEPES, 140 mM NaCl, and 6 mM CaCl₂) containing 2 μg/mL Hoescht 33342 (blue channel), 500-times diluted Annexin V-FITC (green channel), and 1 μg/mL propidium iodide (red channel). High-content image acquisition and analysis are carried out. The program is set to take four images per well. The exposure time is set at 16.7 ms/10% gain, 500 ms/35% gain, and 300 ms/30% gain for the 4,6-diamidino-2-phenylindole, FITC, and rhodamine channels, respectively. Images are processed and the numbers of positive cells for each channel and each condition are determined. In addition, HT29 cells are treated with increasing concentrations of this compound for 32 hours in the absence or the presence of 25, 50, and 100 μM ZvAD-FMK (irreversible general caspase inhibitor), and the same procedures are undertaken. All experiments are done in triplicate. To determine whether the apoptotic effect is due to c-Met inhibition, the effect of this compound when glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) and c-Met are knocked down using siRNA is investigated. HT29, MKN-45, and MDA-MB-231 cells are transfected with a nontargeted control siRNA, a gapgh-targeted control siRNA, or a met-targeted siRNA. After 3 days, c-Met, GAPDH, and β-actin expression levels are determined using specific antibodies. To determine if the effect is caspase dependent, HT29, MKN-45, and MDA-MB-231 cells are transfected with a met-targeted siRNA for 2 days and incubated in the absence or the presence of increasing concentrations of ZvAD-FMK for 1 additional day. A nontargeted siRNA and a gapgh-targeted siRNA (siRNA GAPDH) are also transfected in parallel, as controls. Cells are then stained with Annexin V-FITC and propidium iodide, and the percentage of apoptotic cells is determined.

• Modelli animali

  Female athymic nude mice bearing HT29, MKN-45, or MDA-MB-231 tumor xenografts

• Dosaggi

  200 mg/kg

• Somministrazione

  Orally administered