Alvespimycin (17-DMAG) Hydrochloride

Il 17-DMAG mostra una potenza circa 2 volte superiore contro Hsp90 umana rispetto al 17-AAG, con IC50 di 62 nM contro 119 nM. Nelle cellule SKBR3 e SKOV3 che sovraesprimono la proteina cliente di Hsp90 Her2, il 17-DMAG provoca una down-regulation di Her2 con EC50 di 8 nM e 46 nM, rispettivamente, così come l'induzione di Hsp70 con EC50 di 4 nM e 14 nM, rispettivamente, portando a una significativa citotossicità con GI50 di 29 nM e 32 nM, rispettivamente, coerentemente con l'inibizione di Hsp90. [1] Il 17-DMAG in combinazione con il vorinostat induce sinergicamente l'apoptosi delle cellule MCL coltivate e delle cellule MCL primarie, in modo più potente di ciascun agente da solo, attenuando marcatamente i livelli di ciclina D1 e CDK4, così come di c-Myc, c-RAF e Akt. [3] In contrasto con il 17-AAG che è attivo solo per IKKβ nelle cellule di leucemia linfocitica cronica (CLL), il trattamento con 17-DMAG porta efficacemente all'esaurimento della proteina cliente di Hsp90, con conseguente diminuzione del legame al DNA di NF-κB p50/p65, diminuzione della trascrizione del gene bersaglio di NF-κB e apoptosi caspasi-dipendente. Bersagliando la famiglia NF-κB, il 17-DMAG media selettivamente la citotossicità dose- e tempo-dipendente contro le cellule CLL, ma non contro le cellule T normali o le cellule NK importanti per la sorveglianza immunitaria. [5]

Il trattamento con 17-DMAG a 5 mg/kg o 25 mg/kg tre volte a settimana riduce significativamente la crescita tumorale di xenotrapianti TMK-1, riducendo significativamente l'area dei vasi e il numero di cellule tumorali proliferanti nelle sezioni. [2] Coerentemente con l'inibizione della segnalazione di FAK in vivo, il trattamento con 17-DMAG a 25 mg/kg tre volte a settimana sopprime significativamente la crescita tumorale e la metastasi degli xenotrapianti ME180 e SiHa nei topi. [4] La somministrazione di 17-DMAG a 10 mg/kg per 16 giorni diminuisce significativamente il conteggio dei globuli bianchi e prolunga la sopravvivenza in un modello murino di trapianto TCL1-SCID. [5]

• Saggio di legame competitivo basato sulla polarizzazione della fluorescenza (FP)

  Questo saggio utilizza un analogo della geldanamicina marcato con difluoruro di boro dipirrometene (BODIPY-AG) come sonda e misura la polarizzazione della fluorescenza dopo il legame della sonda a una proteina. La proteina Hsp90 umana nativa (isoforme α + β) è isolata da cellule HeLa. La soluzione di BODIPY-AG è preparata al momento in tampone per saggio FP (20 mM HEPES-KOH, pH 7,3, 1,0 mM EDTA, 100 mM KCl, 5,0 mM MgCl₂, 0,01% NP-40, 0,1 mg/mL di γ-globulina bovina (BGG) fresca, 1,0 mM di DTT fresco e inibitore delle proteasi da soluzione madre in DMSO. Le curve di competizione sono ottenute mescolando 10 μL di ciascuna soluzione contenente BODIPY-AG e Hsp90 e una diluizione seriale di 17-DMAG preparata al momento in tampone per saggio FP da soluzione madre in DMSO. Le concentrazioni finali sono 10 nM BODIPY-AG, 40 o 60 nM Hsp90, concentrazione variabile di 17-DMAG (0,10 nM-10 μM) e ≤0,25% DMSO in una micropiastra a 384 pozzetti. Dopo 3 ore di incubazione a 30 °C, l'anisotropia della fluorescenza (γ_Ex = 485 nm, γ_Em = 535 nm) viene misurata su un lettore di piastre multietichetta EnVision 2100. Il valore di IC50 di 17-DMAG è ottenuto dalle curve di competizione.

• Linee cellulari

  Chronic lymphocytic leukemia (CLL)

• Concentrazioni

  Dissolved in DMSO, final concentrations ~1 μM

• Tempo di incubazione

  24, or 48 hours

• Metodo

  Cells are exposed to various concentrations of 17-DMAG for 24, or 48 hours. For the assessment of cytotoxicity, MTT reagent is then added, and plates are incubated for an additional 24 hours before spectrophotometric measurement. Apoptosis is determined by staining with annexin isothiocyanate and propidium iodide (PI).

• Modelli animali

  SCID mice engrafted with TCL1 leukemia cells

• Dosaggi

  10 mg/kg

• Somministrazione

  Intraperitoneal injection 5 times per week