SB203580 (Adezmapimod)

Adezmapimod (SB203580) inibisce la proliferazione indotta da IL-2 di cellule T umane primarie, cellule T murino CT6 o cellule B BAF F7 con una IC50 di 3–5 μm. Inibisce anche l'attivazione della p70S6 chinasi indotta da IL-2, sebbene la concentrazione richiesta sia leggermente superiore con una IC50 superiore a 10 μm. Questo composto inibisce l'attività di PDK1 in modo dose-dipendente con una IC50 nell'intervallo 3–10 μm. [1] Inibisce la stimolazione di MAPKAPK2 da parte di p38-MAPK con una IC50 di circa 0,07 μM, mentre l'attività totale di SAPK/JNK è inibita con una IC50 di 3–10 μM. A concentrazioni più elevate, attiva la via ERK, che successivamente aumenta l'attività trascrizionale di NF-κB. [2] Induce anche l'autofagia nelle cellule di carcinoma epatocellulare (HCC) umano. [3]

Adezmapimod (SB203580) protegge il miocardio suino dal danno ischemico in un modello in vivo. [4]È anche efficace nella prevenzione e nel trattamento della malattia nel modello murino MRL/lpr del lupus eritematoso sistemico (LES). [5]

• Test di fosforilazione della chinasi del recettore cellulare

  4 μg di anti-PKBα di pecora sono immobilizzati su 25 μL di proteina G-Sepharose per una notte (o 1,5 ore) e lavati in tampone A (50 mm Tris, pH 7,5, 1 mm EDTA, 1 mm EGTA, 0,5 mm Na₃VO₄, 0,1% β-mercaptoetanolo, 1% Triton X-100, 50 mm fluoruro di sodio, 5 mm pirofosfato di sodio, 0,1 mm fluoruro di fenilmetilsulfonile, 1 μg/mL pepstatina, leupeptina e 1 μm microcistina). L'anti-PKB immobilizzato viene quindi incubato con 0,5 mL di lisato (da 5 × 10⁶ cellule) per 1,5 ore e lavato tre volte in 0,5 mL di tampone A supplementato con 0,5 m NaCl, due volte in 0,5 mL di tampone B (50 mm Tris-HCl, pH 7,5, 0,03% (p/v) Brij-35, 0,1 mm EGTA e 0,1% β-mercaptoetanolo), e due volte con 100 μl di tampone di diluizione del saggio; il tampone di diluizione del saggio 5× è 100 mm MOPS, pH 7,2, 125 mm β-glicerofosfato, 25 mm EGTA, 5 mm ortovanadato di sodio, 5 mm DTT. Al complesso immunoenzimatico PKB vengono aggiunti 10 μL di tampone di diluizione del saggio, 40 μm di peptide inibitore della proteina chinasi A, 100 μm di peptide substrato specifico di PKB e 10 μCi di [γ-³²P]ATP, tutti preparati in tampone di diluizione del saggio. La reazione viene incubata per 20 minuti a temperatura ambiente con agitazione, quindi i campioni vengono centrifugati brevemente e 40 μL del volume di reazione vengono trasferiti in un'altra provetta a cui vengono aggiunti 20 μL di acido tricloroacetico al 40% per arrestare la reazione. Questo viene miscelato e incubato per 5 minuti a temperatura ambiente, e 40 μL vengono trasferiti su carta fosfocellulosa P81 e lasciati legare per 30 secondi. Il pezzo di P81 viene lavato tre volte in acido fosforico allo 0,75% quindi in acetone a temperatura ambiente. L'incorporazione di γ-³²P viene quindi misurata mediante conteggio delle scintillazioni.

• Linee cellulari

  CT6 cell , BA/F3 F7 cell

• Concentrazioni

  0–30 μM

• Tempo di incubazione

  1 hour

• Metodo

  CT6 cell and BA/F3 F7 cell are rested by washing three times in RPMI and culturing overnight in RPMI, 5% fetal calf serum in the absence of growth factor, antibiotics, or β-mercaptoethanol supplements. 2–5 × 10⁶ rested CT6 cells are resuspended in 2 mL of RPMI, 5% fetal calf serum and preincubated with Adezmapimod (SB203580) or vehicle control as indicated in figure legends. Cells are then stimulated with 20 ng/ml recombinant human IL-2 for 5 minutes at 37  °C and pelleted in a minifuge for 30 seconds, medium is aspirated, and the pellet is lysed in the appropriate buffer. BA/F3 cells stably expressing deletion mutants of IL-2 receptor β chain are maintained in glutamine containing RPMI further supplemented with 5% fetal calf serum and 0.2 μg/mL G418. The cells are then washed extensively, rested overnight, and washed again before activating with IL-2; such cell preparations are >90% T cells. Cellular proliferation assays are performed by measurement of [³H]thymidine incorporation.

• Modelli animali

  Systemic lupus erythematosus (SLE) are established in female MRL/lpr mice and female C57BL/6 mice

• Dosaggi

  0.1 M/day

• Somministrazione

  Orally administered