Opaganib (ABC294640)

I valori di IC50 per Opaganib (ABC294640) e DMS sono determinati da un nuovo saggio di attività SK basato su HPLC. In breve, i composti in esame vengono incubati con SK1 o SK2 ricombinanti e NBD-Sph nei tamponi di saggio selettivi per isoenzima dettagliati di seguito con 1 mg/ml di albumina sierica bovina priva di acidi grassi, 100 μM ATP e 400 μM MgCl₂. Il prodotto, cioè NBD-S1P, viene separato da NBD-Sph mediante HPLC come segue: sistema HPLC Waters 2795 con un rilevatore di fluorescenza Waters 2495, colonna C8 Chromolith RP-8e (100 × 4.6 mm), fase mobile da 1 ml/min (acetonitrile/tampone di fosfato di sodio 20 mM, pH 2.5, a 45:55). La fluorescenza viene monitorata con eccitazione a 465 nm ed emissione a 531 nm. Il rapporto NBD-S1P/(NBD-Sph + NBD-S1P) viene utilizzato come misura dell'attività SK. I tamponi di saggio selettivi per isoenzima SK contenevano ciascuno 20 mM Tris, pH 7.4, 5 mM EDTA, 5 mM EGTA, 3 mM β-mercaptoetanolo, 5% glicerolo, 1× inibitori di proteasi e 1× inibitori di fosfatasi. Per il tampone di saggio SK1, viene aggiunto 0.25% (finale) di Triton X-100; e per il tampone SK2, viene aggiunto 1 M (finale) di KCl. I saggi vengono eseguiti per 2 ore a temperatura ambiente, e quindi viene aggiunto un volume di metanolo pari a 1.5 per terminare la reazione della chinasi. Dopo 10 minuti, i campioni vengono centrifugati a 20.000 g per pellettare la proteina precipitata, e i surnatanti vengono analizzati mediante HPLC. Negli esperimenti per determinare il Ki per l'inibizione di SK2 da parte di questo composto, viene utilizzato il sistema di saggio ADP Quest per misurare l'attività della chinasi in presenza di concentrazioni variabili di sfingosina e del composto. Per determinare gli effetti di Opaganib sull'attività cellulare di SK, le cellule MDA-MB-231 quasi confluenti vengono private del siero durante la notte, e quindi trattate con concentrazioni variabili del composto. Le cellule vengono quindi incubate con [³H]sfingosina a una concentrazione finale di 1 μM. Le cellule assorbono la sfingosina esogena, che viene convertita in S1P tramite l'attività di SK, e [³H]S1P viene separata da [³H]sfingosina mediante estrazione e quantificata mediante conteggio per scintillazione.

1025LU, Hep-G2, A-498, MCF-7, Caco-2, MDA-MB-231, HT-29, Panc-1, DU145, T24, and SK-OV-3 cell lines

~50 μM

72 h

To determine the effects of the test compounds on proliferation, cells are plated into 96-well microtiter plates and allowed to attach for 24 h. Varying concentrations of Opaganib (ABC294640) are added to individual wells and the cells are incubated for an additional 72 h. At the end of this period, the number of viable cells is determined by use of the sulforhodamine-binding assay. The percentage of cells killed is calculated as the percentage decrease in sulforhodamine-binding compared with control cultures. Regression analyses of inhibition curves are performed by use of GraphPad Prism.

Female BALB/c mice bearing JC tumors

~100 mg/kg

p.o.