A-769662

A-769662 stimola l'AMPK parzialmente purificata dal fegato di ratto con un EC50 di 0,8 μM. Questo composto attiva l'AMPK purificata da più tessuti e specie in modo dose-risposta con modeste variazioni negli EC50 osservati. Gli EC50 determinati per questa sostanza chimica utilizzando estratti di AMPK parzialmente purificati da cuore di ratto, muscolo di ratto o cellule renali embrionali umane (HEK) sono rispettivamente 2,2 mM, 1,9 mM o 1,1 mM. Un trattamento di 4 ore di epatociti primari di ratto con questo composto aumenta la fosforilazione di ACC in modo dose-dipendente, che ha correlato l'inibizione della sintesi degli acidi grassi con un IC50 di 3,2 μM. Inibisce anche la sintesi degli acidi grassi negli epatociti di topo con un IC50 di 3,6 μM [1] Questo composto attiva l'AMPK sia allostericamente che inibendo la defosforilazione di AMPK su Thr-172, simile agli effetti dell'AMP. [2] Inibisce la funzione proteasomale tramite un meccanismo AMPK-indipendente. Questa sostanza chimica influisce sull'attività in vitro dei proteasomi 26S purificati ma non sull'attività in vitro dei proteasomi 20S purificati. Ha effetti tossici sulle cellule MEF. [3] Una recente ricerca mostra che questo composto ha inibito la proliferazione cellulare e la sintesi del DNA. [4]

Il trattamento a breve termine di ratti Sprague Dawley normali con A-769662 diminuisce i livelli di malonil CoA epatico e il rapporto di scambio respiratorio, VCO2/VO2, indicando un aumento del tasso di ossidazione degli acidi grassi in tutto il corpo. Il trattamento di topi ob/ob con 30 mg/kg b.i.d. di questo composto diminuisce l'espressione epatica di PEPCK, G6Pasi e FAS, abbassa la glicemia plasmatica del 40%, riduce l'aumento di peso corporeo e diminuisce significativamente sia i livelli di trigliceridi plasmatici che epatici. [1]

• saggio AMPK a 96 pozzetti

  L'attività di AMPK viene misurata monitorando la fosforilazione del substrato peptidico SAMS (20 μM in saggi standard e 100 μM in saggi di additività) seguendo un protocollo precedentemente descritto (Anderson et al., 2004). Per determinare se l'attivazione di AMPK indotta da A-769662 avviene in modo reversibile, l'AMP o questo composto vengono preincubati con AMPK di fegato di ratto per 10 minuti a 20 volte le concentrazioni standard del saggio prima della diluizione e della misurazione dell'attività di AMPK.

  [1]

• Linee cellulari

  MEF cells

• Concentrazioni

  300 μM

• Tempo di incubazione

  24 hours

• Metodo

  Cell viability of MEF cells treated or not with A-769662 is performed as follows: cells are harvested by trypsinization and incubated with 0.5 mg/mL RNase and 50 μg/mL propidium iodine at room temperature in the dark; cell viability is analyzed by flow cytometry using a FACScanto flow cytometer, using an excitation laser at 488 nm and a propidium iodine fluorescence detection at 600 nm. To determine the proportion of cells in each phase of the cell cycle, cells are harvested by trypsinization, collected by centrifugation, washed in PBS and fixed overnight in 80% ethanol at -20 °C. Subsequently, these fixed cells are centrifuged to remove the fixative and incubated for 20 minutes in the dark at room temperature in PBS containing 0.5 mg/mL RNase and 50 μg/mL propidium iodine. Flow cytometry analysis is performed as above. The proportion of cells in G1, S, and G2 is determined using the MODFIT program. Cell culture pictures are taken at the indicated times using a camera coupled to an inverted microscope with a 20 × objective.

• Modelli animali

  Sprague Dawley rats

• Dosaggi

  30 mg/kg

• Somministrazione

  Administered via i.p.