ZSTK474

ZSTK474 a 1 μM riduce potentemente l'attività di PI3K al 4,7% del livello di controllo, mentre LY2194002 riduce l'attività solo al 44,6% del controllo. Questo composto inibisce le attività delle p110β, -γ e -δ ricombinanti con IC50 di 17 nM, 53 nM e 6 nM, rispettivamente. Mostra una potente attività antiproliferativa contro un pannello di 39 linee cellulari di cancro umano con una GI50 media di 0,32 μM, più efficacemente rispetto a LY294002 o wortmannin con una GI50 media di 7,4 μM o 10 μM, rispettivamente. Questo trattamento chimico a 1 μM blocca il ruffling della membrana e la generazione di PIP3 indotta dal fattore di crescita derivato dalle piastrine in fibroblasti embrionali murini (MEF). A 10 μM induce l'apoptosi nelle cellule OVCAR3 e induce un arresto completo della fase G1 ma non l'apoptosi nelle cellule A549. Questo trattamento con il composto a 0,5 μM diminuisce significativamente il livello di Akt e GSK-3β fosforilati, così come l'espressione della proteina ciclina D1. Inibisce anche la fosforilazione di altri componenti di segnalazione a valle coinvolti nella regolazione della proliferazione cellulare, inclusi FKHRL1, FKHR, TSC-2, mTOR e p70S6K in modo dose-dipendente. [1] Questa sostanza chimica non inibisce mTOR a 0,1 μM, e anche a una concentrazione di 100 μM, inibisce l'attività di mTOR meno del 40%. [2] Blocca la migrazione cellulare indotta da VEGF e la formazione di tubi nelle cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC), e inibisce l'espressione di HIF-1α e la secrezione di VEGF nelle cellule RXF-631L, esibendo una potente attività antiangiogenica in vitro. [3] Questo trattamento con il composto inibisce la produzione di IFNγ e IL-17 nelle cellule T attivate dalla concanavalina A e inibisce la proliferazione e la produzione di PGE(2) da parte delle cellule sinoviali simili a fibroblasti (FLS). [6]

• Inibizione dell'attività di PI3K

  Le cellule A549 vengono lisate in un tampone contenente 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA e 1% Igepal CA-630, i lisati vengono centrifugati a 20.000 g e 4 °C per 10 minuti e i surnatanti vengono utilizzati come lisato cellulare (proteina = 2-4 mg/mL). Per immunoprecipitare la PI3K, 200 μL di lisato cellulare vengono incubati con anticorpo policlonale anti-p85 e proteina G-agarosio (5 μL). Le PI3Kα, PI3Kβ e PI3Kδ possono essere immunoprecipitate dall'anticorpo policlonale anti-p85. Le sfere di agarosio contenenti gli immunoprecipitati vengono lavate due volte con il tampone A (20 mM Tris-HCl a pH 7,5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA e 1% Igepal CA-630), una volta con il tampone B (500 mM LiCl e 100 mM Tris-HCl a pH 7,5), una volta con acqua distillata e una volta con il tampone C (100 mM NaCl e 20 mM Tris-HCl a pH 7,5). Gli immunoprecipitati vengono sospesi in 20 μL di tampone C contenente fosfatidilinositolo a 200 μg/mL. La miscela viene preincubata con concentrazioni crescenti di questo composto a 25 °C per 5 minuti. Vengono aggiunti [γ-³²P]ATP (2 μCi per miscela di saggio; concentrazione finale, 20 μM) e MgCl₂ (concentrazione finale, 20 mM) per avviare la reazione. La miscela di reazione viene incubata a 25 °C per 20 minuti. I prodotti fosforilati del fosfatidilinositolo vengono separati mediante cromatografia su strato sottile e visualizzati mediante autoradiografia. La regione del fosfatidilinositolo-3-fosfato viene raschiata dalla piastra e la radioattività viene misurata anche con spettroscopia a scintillazione liquida. Il livello di inibizione di questa sostanza chimica viene determinato come la percentuale di conteggi di ³²P per minuto ottenuti senza questo composto.

• Linee cellulari

  MCF-7, HT-29, HCT-116, OVCAR3, A549, et al.

• Concentrazioni

  Dissolved in DMSO, final concentrations ~10 μM

• Tempo di incubazione

  48 hours

• Metodo

  Cells are exposed to increasing concentrations of ZSTK474 for 48 hours. The inhibition of cell proliferation is assessed by measuring changes in total cellular protein by use of a sulforhodamine B assay. Apoptosis is assessed by chromatin condensation or by flow cytometry. For chromatin condensation assay, cells are stained with Hoechst 33342 and examined by fluorescence microscopy. Morphologic changes induced by this compound, such as the condensation of chromatin, are indicative of apoptosis. For flow cytometry analysis, cells are harvested, washed with ice-cold PBS, and fixed in 70% ethanol. Cells are then washed twice with ice-cold PBS again, treated with RNase A (500 μg/mL) at 37 °C for 1 hour, and stained with propidium iodide (25 μg/mL). The DNA content of the cells is analyzed with a flow cytometer.

• Modelli animali

  Male BDF1 mice injected subcutaneously with B16F10 cells, and female BALB/c nude mice inoculated subcutaneously with A549, PC-3, or WiDr cells

• Dosaggi

  ~400 mg/kg/day

• Somministrazione

  Orally