Foretinib

L'inibizione chinasica viene investigata utilizzando uno dei tre formati di saggio: trasferimento di [³³P]fosforile, chemioluminescenza accoppiata a luciferasi o tecnologia AlphaScreen Protein Tyrosine Kinase. Gli IC50 sono calcolati mediante analisi di regressione non lineare utilizzando XLFit. Saggio chinasico con trasferimento di ³³P-fosforile Le reazioni vengono eseguite in piastre per microtitolazione bianche a 384 pozzetti, con fondo trasparente e ad alto legame (Greiner, Monroe, NC). Le piastre sono rivestite con 2 μg/pozzetto di proteina o substrato peptidico in un volume di 50 μL di tampone di rivestimento contenente 40 μg/mL di substrato (poli(Glu, Tyr) 4:1, 22,5 mM Na2CO₃, 27,5 mM NaHCO₃, 50 mM NaCl e 3 mM NaN₃. Le piastre rivestite vengono lavate una volta con 50 μL di tampone di saggio dopo un'incubazione notturna a temperatura ambiente (TA). I composti di prova e gli enzimi sono combinati con ³³P-γ-ATP (3,3 μCi/nmol) in un volume totale di 20 μL. La miscela di reazione viene incubata a TA per 2 ore e terminata per aspirazione. Le piastre per microtitolazione vengono successivamente lavate 6 volte con tampone Tween-PBS (PBST) allo 0,05%. Viene aggiunto liquido di scintillazione (50 μL/pozzetto) e il ³³P incorporato viene misurato mediante spettrometria a scintillazione liquida utilizzando un contatore a scintillazione MicroBeta. Saggio di chemioluminescenza accoppiata a luciferasi Le reazioni vengono condotte in piastre per microtitolazione bianche a 384 pozzetti con legame medio (Greiner). In una prima fase, enzima e composto vengono combinati e incubati per 60 minuti; le reazioni vengono avviate mediante l'aggiunta di ATP e substrato peptidico (poli(Glu, Tyr) 4:1) in un volume finale di 20 μL, e incubate a TA per 2-4 ore. Dopo la reazione chinasica, viene aggiunta un'aliquota di 20 μL di Kinase Glo (Promega, Madison, WI) e il segnale di luminescenza viene misurato utilizzando un lettore di piastre Victor. Il consumo totale di ATP è limitato al 50%. Saggio di Protein Tyrosine Kinase AlphaScreen™ Vengono utilizzate perle donatrici rivestite con streptavidina e perle accettrici rivestite con anticorpo anti-fosfotirosina PY100. Come substrato viene utilizzato poli(Glu,Tyr) 4:1 biotinilato. La fosforilazione del substrato viene misurata mediante l'aggiunta di perle donatrici/accettrici per luminescenza dopo la formazione del complesso perla donatrice-accettrice. La Protein Tyrosine Kinase e i composti di prova vengono combinati e preincubati per 60 minuti, seguiti dall'aggiunta di ATP e poli(Glu, Tyr) biotinilato in un volume totale di 20 μL in piastre per microtitolazione bianche a 384 pozzetti con legame medio (Greiner). Le miscele di reazione vengono incubate per 1 ora a temperatura ambiente. Le reazioni vengono bloccate mediante l'aggiunta di 10 μL di sospensione di perle AlphaScreen da 15-30 μg/mL contenente 75 mM Hepes, pH 7,4, 300 mM NaCl, 120 mM EDTA, 0,3% BSA e 0,03% Tween-20. Dopo 2-16 ore di incubazione a temperatura ambiente, le piastre vengono lette utilizzando un lettore AlphaQuest.

B16F10, A549, and HT29 cells

40 nM

12 to 14 days

B16F10, A549, and HT29 cells (1.2× 10³ per well) are mixed with soft agar and seeded in a 96-well plate containing 10% FBS and EXEL-2880 over a base agar layer. For normoxic conditions, the plates are incubated (37°C) for 12 to 14 days in 21% oxygen, 5% CO₂, and 74% nitrogen, whereas incubation (37 °C) under hypoxic conditions is done in a hypoxia chamber in 1% oxygen, 5% CO₂, and 94% nitrogen. The number of colonies is evaluated under each condition following addition of 50% Alamar Blue and fluorescence detection.

B16F10 tumor cells (2 × 10 ⁵) are implanted via i.v. tail vein injection into athymic nude mice (NCr or BALB/c) 5 to 8 weeks old

100 mg/kg

Administered via oral gavage