VX-809 (Lumacaftor)

Lumacaftor (VX-809) agisce a livello del RE per permettere a una frazione del F508del-CFTR di adottare una forma correttamente ripiegata, di uscire dal RE e di mobilizzarsi verso la superficie cellulare per un normale funzionamento. Nelle cellule tiroidee di ratto Fischer (FRT) che esprimono F508del-CFTR, il trattamento con questo composto migliora significativamente la maturazione del F508del-CFTR di 7,1 volte con una EC50 di 0,1 μM, e potenzia il trasporto di cloruro mediato dal F508del-CFTR di circa 5 volte con una EC50 di 0,5 μM, mentre VRT-768 ha valori di EC50 più elevati di 7,9 μM e 16 μM, rispettivamente. Nelle cellule HEK-293 che esprimono F508del-CFTR, esso (3 μM) aumenta l'uscita del F508del-CFTR dal RE di 6 volte, raggiungendo livelli paragonabili al 34% del CFTR. Nelle cellule epiteliali bronchiali umane primarie (HBE) con mutazione F508del-CFTR, l'agente aumenta la maturazione del CFTR e potenzia la secrezione di cloruro con EC50 di 350 nM e 81 nM, rispettivamente, più efficace di Corr-4a e VRT-325. Il F508del-CFTR corretto da esso mostra una probabilità di apertura di singolo canale di 0,39 simile al CFTR normale di 0,40. A differenza di VX-770, non è un potenziatore del CFTR, poiché un'aggiunta acuta non ha alcun effetto sulla funzione del F508del-CFTR. Contrariamente a VRT-325 e Corr-4a, non migliora la lavorazione delle forme normali o mutanti di hERG o P-gp, così come altre proteine mislocalizzate che causano malattie, inclusi il mutante Z di α1-antitripsina (E342K-α1-AT) o la N370S-β-glucosidasi, suggerendo che è specifico per il CFTR. Esso in combinazione con VRT-325 o Corr-4a ha un effetto additivo sul trasporto di cloruro mediato dal CFTR in F508del-HBE coltivate. [1]

Lumacaftor (VX-809; VRT 826809) è un modulatore del CFTR che corregge il ripiegamento e il traffico della proteina CFTR.

• maturazione del F508del-CFTR

  Le cellule FRT che esprimono stabilmente F508del-CFTR vengono trattate con concentrazioni crescenti di Lumacaftor (VX-809) per 48 ore. Dopo l'incubazione, le cellule vengono raccolte in soluzione D-PBS ghiacciata (senza calcio e magnesio) e centrifugate a 1.000 × g a 4 °C. I pellet cellulari vengono lisati in 1% Nonidet P-40, 0,5% desossicolato di sodio, 200 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 7,8 e 1 mM EDTA più miscela di inibitori di proteasi (1:250) per 30 minuti su ghiaccio. I lisati vengono centrifugati per 10 minuti a 10.000 × g a 4 °C per pelletizzare i nuclei e il materiale insolubile. Circa 12 μg di proteine totali vengono riscaldate in tampone di Laemmli con 5% β-mercaptoetanolo a 37 °C per 5 minuti e caricate su un gel Tris-acetato dal 3% all'8%. Il gel viene trasferito su nitrocellulosa e processato per Western blotting utilizzando un anticorpo monoclonale CFTR o policlonale per GAPDH. I blot vengono sviluppati mediante chemiluminescenza potenziata. La quantificazione delle quantità relative delle bande C e GAPDH viene eseguita utilizzando l'analisi NIH ImageJ dei film scansionati.

• Linee cellulari

  FRT (CFTR or F508del-CFTR), HEK-293 (CFTT or F508del-CFTR) , and HBE cells

• Concentrazioni

  Dissolved in DMSO, final concentrations ~0.1 mM

• Tempo di incubazione

  24 or 48 hours

• Metodo

  Cells are exposed to various concentrations of Lumacaftor (VX-809) for 24 or 48 hours. Ussing chamber techniques are used to record the transepithelial current (I_T) resulting from CFTR-mediated chloride transport. The single-channel activity of CFTR is measured by using excised inside-out membrane patch recordings. Immunoblot techniques using the monoclonal CFTR antibody are used to measure CFTR maturation in FRT, HEK-293, or HBE cells expressing CFTR or F508del-CFTR.

• Modelli animali

  Male Sprague– Dawley rats

• Dosaggi

  1 mg/kg

• Somministrazione

  p.o.