U0126-EtOH

U0126-EtOH antagonizza funzionalmente l'attività trascrizionale di AP-1 e blocca la produzione di una varietà di citochine e metalloproteinasi coinvolte nella risposta infiammatoria. [1] Questo composto inibisce la proliferazione delle cellule T in risposta a stimolazione antigenica o a anti-CD3 più anti-CD28 Abs cross-linked senza effetto sulla proliferazione indotta da IL-2, mediante la down-regolazione dei livelli di mRNA di IL-2. [2] Uno studio recente mostra che questa sostanza chimica antagonizza l'apoptosi indotta dal resveratrolo nelle cellule C4-2 di cancro alla prostata umano resistente alla castrazione, inibisce la funzione mitocondriale e sposta le cellule verso la glicolisi aerobica indipendentemente da MEK. [3]

U0126-EtOH, come inibitore della via di segnalazione intracellulare Raf/MEK/ERK, dimostra attività antivirale sopprimendo la propagazione della variante pandemica del 2009 dell'IV H1N1 e dei virus dell'influenza aviaria altamente patogeni (HPAIV) in vivo nel polmone di topo mediante inibizione. [4] Questo composto mostra un potenziale effetto neuroprotettivo e migliora l'apprendimento spaziale nel labirinto acquatico di Morris (MWM) attivando il coattivatore gamma del recettore attivato dai proliferatori di perossisomi-1a, il fattore respiratorio nucleare 1 e il fattore di trascrizione mitocondriale A nei ratti iniettati con Aβ. [5]

• Saggi chinasici in vitro

  La quantità di MEK di tipo selvatico immunoprecipitata utilizzata in questi saggi viene aggiustata per ottenere una quantità simile di unità di attività a quella ottenuta con 10 nM di MEK ricombinante. Le velocità di reazione sono misurate utilizzando un apparato di filtraggio su nitrocellulosa a 96 pozzetti come descritto di seguito. Salvo diversa indicazione, le reazioni vengono condotte a una concentrazione enzimatica di 10 nM, in 20 mM Hepes, 10 mM MgCl₂, 5 mM β-mercaptoetanolo, 0,1 mg/mL BSA, pH 7,4, a temperatura ambiente. Le reazioni vengono avviate con l'aggiunta di [γ-³³P]ATP nella miscela di reazione premiscelata MEK/ERK/questo composto, e un'aliquota di 100 μL viene prelevata ogni 6 minuti e trasferita alla piastra a membrana di nitrocellulosa a 96 pozzetti che contiene 50 mM di EDTA per arrestare la reazione. La piastra a membrana viene aspirata e lavata 4 volte con tampone sotto vuoto. I pozzetti vengono quindi riempiti con 30 μL di liquido di scintillazione Microscint-20, e la radioattività dell'ERK fosforilato con ³³P viene contata con un contatore a scintillazione Top Count. Le velocità sono ottenute dalle pendenze dei grafici di radioattività rispetto al tempo. Le concentrazioni di ERK e ATP sono rispettivamente 400 nM e 40 μM, salvo diversa indicazione. Per tutti i saggi enzimatici in vitro, la percentuale di inibizione è calcolata 100 (1 −Vi/Vo) dove Vi e Vo sono le velocità di reazione iniziali in presenza e in assenza di questo prodotto chimico, rispettivamente. I dati vengono quindi rappresentati graficamente come percentuale di inibizione in funzione della concentrazione di questo composto e adattati, mediante regressione non lineare dei minimi quadrati, all'equazione standard per un'isoterma di Langmuir per determinare l'IC50. Come riportato, le concentrazioni enzimatiche sono basate sui pesi molecolari e sulla massa di proteine utilizzate nel volume finale del saggio e non sulla titolazione del sito attivo. Pertanto, la concentrazione effettiva del sito attivo dell'enzima può differire da quella riportata.

• Linee cellulari

  A.E7 or Th17 cells

• Concentrazioni

  0 to 10 μM

• Tempo di incubazione

  48 hours

• Metodo

  A.E7 or Th17 cells are incubated with C-treated B10.BR or BALB/c splenocytes plus varying concentrations of pigeon cytochrome c or PR8 Ag, or with 5 U/mL human rIL-2. In addition, some assays contains U0126-EtOH or an inactive analogue, U0124, to determine direct effects of MEK inhibition on T cell proliferation. Two days after culture initiation, each well is pulsed with 1 µCi of [³H]TdR and harvested the following day. The incorporation of [³H]TdR into DNA is quantitated on a Packard Matrix 96 direct beta counter without the use of liquid scintillation mixtures.

• Modelli animali

  Female C57Bl/6 mice infected by Mouse-adapted highly pathogenic avian influenza A/FPV/Bratislava/79 (H7N7; FPV) virus and swine origin human influenza A virus (SOIV) A/Regensburg/D6/2009 (H1N1v; RB1).

• Dosaggi

  ≤10 mM

• Somministrazione

  Administered via aerosol.