Tandutinib (MLN518)

Tandutinib (MLN518) ha scarsa attività contro EGFR, FGFR, KDR, InsR, Src, Abl, PKC, PKA e MAPK. Inibisce la crescita cellulare IL-3-indipendente e l'autofosforilazione di FLT3-ITD con un IC50 di 10-100 nM. Questo composto inibisce anche la proliferazione delle cellule di leucemia umana Ba/F3 contenenti mutazioni FLT3-ITD con valori di IC50 di 10-30 nM, e le cellule Molm-13 e Molm-14 positive per FLT3-ITD con un IC50 di 10 nM. Nelle cellule Molm-14 positive per FLT3-ITD, ma non nelle cellule THP-1 negative per FLT3-ITD, il trattamento con Tandutinib porta ad una significativa apoptosi del 51% e 78% a 24 e 96 ore, rispettivamente, a causa della specifica inibizione di FLT3. [1] Inibisce preferenzialmente la crescita delle colonie blastiche da pazienti con AML FLT3 ITD-positivi rispetto ai pazienti ITD-negativi, senza influenzare la formazione di colonie da parte delle normali cellule progenitrici umane. [2]

L'amministrazione orale di Tandutinib (MLN518) a 60 mg/kg bid aumenta significativamente la sopravvivenza nei topi portatori di cellule Ba/F3 che esprimono il mutante W51 FLT3-ITD, e fornisce una significativa riduzione della mortalità in un modello di trapianto di midollo osseo murino. [1] Il trattamento con questo composto a 180 mg/kg due volte al giorno ha una lieve tossicità verso l'emopoiesi normale, tuttavia, è una dose efficace nel trattamento della leucemia FLT3 ITD-positiva nei topi. [2]

• Saggi di autofosforilazione del recettore basati su cellule

  I saggi di autofosforilazione della chinasi della famiglia PDGFR sono saggi immunoenzimatici (ELISA) basati su cellule che utilizzano cellule CHO che esprimono PDGFRβ wild-type, la proteina chimerica PDGFRβ/c-Kit e PDGFRβ/Flt3 che contengono i domini extracellulare e transmembrana di PDGFRβ e il dominio citoplasmatico di c-Kit, e Flt-3. Le cellule vengono coltivate fino alla confluenza in piastre di microtitolazione a 96 pozzetti in condizioni standard di coltura tissutale, seguite da privazione del siero per 16 ore. Brevemente, le cellule quiescenti vengono incubate a 37 °C con concentrazioni crescenti di Tandutinib (MLN518) per 30 minuti, seguita dall'aggiunta di 8 nM di PDGF-BB per 10 minuti. Le cellule vengono lisate in 100 mM Tris, pH 7.5, 750 mM NaCl, 0.5% Triton X-100, 10 mM pirofosfato di sodio, 50 mM NaF, 10 μg/mL leupeptina, 1 mM fenilmetilsolfonil fluoruro, 1 mM vanadato di sodio, e il lisato viene chiarificato per centrifugazione a 15.000g per 5 minuti. I lisati chiarificati vengono trasferiti in una seconda piastra di microtitolazione in cui i pozzetti sono stati precedentemente rivestiti con 500 ng/pozzetto di mAb anti-PDGFRβ 1B5B11 e quindi incubati per 2 ore a temperatura ambiente. Dopo aver lavato tre volte con tampone di legame (0.3% gelatina, 25 mM HEPES, pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.01% Tween 20), vengono aggiunti 250 ng/mL di anticorpo policlonale anti-fosfotirosina di coniglio e le piastre vengono incubate a 37 °C per 60 minuti. Successivamente, ogni pozzetto viene lavato tre volte con tampone di legame e incubato con 1 μg/mL di anticorpo anti-coniglio coniugato alla perossidasi di rafano a 37 °C per 60 minuti. I pozzetti vengono lavati prima di aggiungere 2,2

• Linee cellulari

  Ba/F3, Molm-13, Molm-14, HL60, AML193, KG-1, KG-1a, THP-1, and RS4;11

• Concentrazioni

  Dissolved in DMSO, final concentrations ~30 μM

• Tempo di incubazione

  ~7 days

• Metodo

  Cells are exposed to increasing concentrations of Tandutinib (MLN518) (0.004-30 μM). They are grown for 3-7 days in tissue culture, and viable cells, determined by Trypan blue dye exclusion, are counted. At daily intervals, cells are harvested, washed, and resuspended in 100 uL binding buffer containing 10 mM HEPES (pH 7.4), 140 mM NaCl, and 2.5 mM CaCl₂. Annexin V-FITC (100 ng) and propidium iodide (250 ng) are added to the cell suspension followed by incubation at room temperature for 15 minutes. Flow cytometry is performed immediately after staining on a FACSort flow cytometer with excitation at 488 nm. Fluorescence of annexin V-FITC and DNA propidium iodide staining are measured at 515 nm and 585 nm, respectively.

• Modelli animali

  Female athymic nude (nu/nu) mice injected with Ba/F3 cells expressing W51 FLT3-ITD mutant

• Dosaggi

  40-120 mg/kg/day

• Somministrazione

  Orally by gavage