Sorafenib Tosylate (BAY 43-9006)

Il Sorafenib tosylate inibisce l'attività di B-Raf sia wild-type che mutante V599E con IC50 di 22 nM e 38 nM, rispettivamente. Questo composto inibisce potentemente anche mVEGFR2 (Flk-1), mVEGFR3, mPDGFRβ, Flt3 e c-Kit con IC50 di 15 nM, 20 nM, 57 nM, 58 nM e 68 nM, rispettivamente. Inibisce debolmente FGFR-1 con IC50 di 580 nM. Questo composto chimico non è attivo contro ERK-1, MEK-1, EGFR, HER-2, IGFR-1, c-Met, PKB, PKA, cdk1/cyclinB, PKCα, PKCγ e pim-1. Inibisce marcatamente la fosforilazione di VEGFR2 nelle cellule NIH 3T3 con IC50 di 30 nM e la fosforilazione di Flt-3 nelle cellule HEK-293 con IC50 di 20 nM. Blocca potentemente la fosforilazione di MEK 1/2 e ERK 1/2 nella maggior parte delle linee cellulari, ma non nelle cellule A549 o H460, pur non avendo alcun effetto sull'inibizione della via PKB. Inibisce la proliferazione delle cellule HAoSMC e MDA-MB-231 con IC50 di 0,28 μM e 2,6 μM, rispettivamente. [1] Oltre all'inibizione della via di segnalazione RAF/MEK/ERK, inibisce significativamente la fosforilazione di eIF4E e down-regola i livelli di Mcl-1 nelle cellule di carcinoma epatocellulare (HCC) in modo MEK/ERK-indipendente. Inibisce la proliferazione delle cellule PLC/PRF/5 e HepG2 con IC50 di 6,3 μM e 4,5 μM, rispettivamente, e porta a una significativa induzione di apoptosi. [2]

L'amministrazione orale di Sorafenib tosylate (~60 mg/kg) dimostra un'attività antitumorale ad ampio spettro e dose-dipendente contro una varietà di modelli di xenotrapianto di tumore umano, inclusi MDA-MB-231, Colo-205, HT-29, DLD-1, NCI-H460 e A549, senza evidenza di tossicità. In associazione con l'efficacia antitumorale, il trattamento con questo composto inibisce potentemente la fosforilazione di MEK 1/2 e i livelli di pERK 1/2 negli xenotrapianti HT-29 e MDA-MB-231 ma non negli xenotrapianti Colo-205, e sopprime significativamente l'area dei microvasi tumorali (MVA) e la densità dei microvasi (MVD) negli xenotrapianti tumorali MDA MB-231, HT-29 e Colo-205. [1] Il trattamento con questo composto produce un'inibizione della crescita dose-dipendente di xenotrapianti tumorali PLC/PRF/5 in topi SCID con TGI del 49% e 78% a 10 mg/kg e 30 mg/kg, rispettivamente, coerentemente con l'inibizione della fosforilazione di ERK e eIF4E, la riduzione dell'area dei microvasi e l'induzione dell'apoptosi delle cellule tumorali. [2]

• Saggi biochimici

  I baculovirus ricombinanti che esprimono Raf-1 (residui 305–648) e B-Raf (residui 409–765) sono purificati come proteine di fusione. Il MEK-1 umano a lunghezza intera è generato mediante PCR e purificato come proteina di fusione da lisati di Escherichia coli. Sorafenib tosylate viene aggiunto a una miscela di Raf-1 (80 ng), o B-Raf (80 ng) con MEK-1 (1 μg) in tampone di saggio [20 mM Tris (pH 8.2), 100 mM NaCl, 5 mM MgCl₂ e 0.15% β-mercaptoetanolo] a una concentrazione finale di 1% DMSO. Il saggio della chinasi Raf (volume finale di 50 μL) viene avviato aggiungendo 25 μL di 10 μM γ[³³P]ATP (400 Ci/mol) e incubato a 32 °C per 25 minuti. Il MEK-1 fosforilato viene raccolto per filtrazione su un tappeto di fosfocellulosa e l'1% di acido fosforico viene utilizzato per lavare via la radioattività non legata. Dopo l'essiccazione mediante riscaldamento a microonde, un contatore a piastre β viene utilizzato per quantificare la radioattività legata al filtro. Il dominio chinasico di VEGFR2 (KDR) umano viene espresso e purificato da lisati di Sf9. I saggi di trasferimento di energia a fluorescenza risolti nel tempo per VEGFR2 vengono eseguiti in piastre opache a 96 pozzetti nel formato di trasferimento di energia a fluorescenza risolti nel tempo. Le condizioni di reazione finali sono le seguenti: da 1 a 10 μM ATP, 25 nM poli GT-biotina, 2 nM anticorpo fosfo (p)-Tyr marcato con europio (PY20), 10 nM APC, da 1 a 7 nM di dominio chinasico citoplasmatico in concentrazioni finali di 1% DMSO, 50 mM HEPES (pH 7.5), 10 mM MgCl₂, 0.1 mM EDTA, 0.015% Brij-35, 0.1 mg/mL BSA e 0.1% β-mercaptoetanolo. I volumi di reazione sono di 100 μL e vengono avviati con l'aggiunta dell'enzima. Le piastre vengono lette a 615 e 665 nM su un contatore Perkin-Elmer VictorV Multilabel circa 1.5-2.0 ore dopo l'avvio della reazione. Il segnale viene calcolato come un rapporto: (665 nm/615 nM) × 10.000 per ogni pozzetto. Per la generazione dell'IC50, questo composto viene aggiunto prima dell'avvio dell'enzima. Viene preparata una piastra madre 50x con questo composto diluito in serie 1:3 in una soluzione al 50% di DMSO/50% di acqua distillata. Le concentrazioni finali di questo composto variano da 10 μM a 4.56 nM in 1% DMSO.

• Linee cellulari

  MDA-MB-231, and HAoSMC

• Concentrazioni

  Dissolved in DMSO, final concentrations ~10 μM

• Tempo di incubazione

  72 hours

• Metodo

  Cells are exposed to increasing concentrations of Sorafenib tosylate for 72 hours. Cell number is quantitated using the Cell TiterGlo ATP Luminescent assay kit. This assay measures the number of viable cells per well by measurement of luminescent signal based on amount of cellular ATP.

• Modelli animali

  Female NCr-nu/nu mice implanted s.c. with MDA-MB-231, Colo-205, HT-29, H460, or A549 cells

• Dosaggi

  ~60 mg/kg

• Somministrazione

  Orally once daily