SB743921 HCl

I domini motori della KSP (aminoacidi 1–360) sono espressi in Escherichia coli BL21(DE3) come proteine di fusione 6-His COOH-terminali. I pellet batterici vengono lisati in un microfluidizzatore con un tampone di lisi [50 mM Tris-HCl; 50 mM KCl, 10 mM imidazolo, 2 mM MgCl₂, 8 mM β-mercaptoetanolo, 0,1 mM ATP (pH 7,4)], e le proteine vengono purificate usando cromatografia di affinità su agarosio Ni-NTA, con un tampone di eluizione costituito da 50 mM PIPES, 10% saccarosio, 300 mM imidazolo, 50 mM KCl, 2 mM MgCl₂, mM β-mercaptoetanolo e 0,1 mM ATP (pH 6,8). Le misurazioni dello stato stazionario dell'attività ATPasica vengono eseguite con un sistema di rilevamento piruvato chinasi-lattato deidrogenasi che accoppia la comparsa di ADP con l'ossidazione di NADH. I cambiamenti di assorbanza vengono monitorati a 340 nm. Tutti gli esperimenti biochimici vengono eseguiti in tampone PEM25 [25 mM Pipes/KOH (pH 6,8), 2 mM MgCl₂, 1 mM EGTA] supplementato con 10 μM SB 743921 per esperimenti che coinvolgono i microtubuli. Le velocità di rilascio di ADP vengono misurate in un apparato a flusso interrotto; viene monitorata la diminuzione della fluorescenza di MANT-ATP. Le velocità di rilascio di Pi vengono misurate in un apparato a flusso interrotto, utilizzando una proteina batterica legante il fosfato modificata con il colorante 7-dietilammino-3-((((2 maleimmidil)etil)ammino)carbonil)cumarina (MDCC). Le stime di K_i degli inibitori di KSP vengono estratte dalle curve dose-risposta, con correzione esplicita per la concentrazione enzimatica. La polimerizzazione della tubulina misurando i cambiamenti di assorbanza a 340 nm viene monitorata. Il saggio viene eseguito in volumi di 100 μL in piastre per microtitolazione a 96 pozzetti a mezza area, utilizzando un lettore di micropiastre con la temperatura di incubazione impostata a 37 °C.

HeLa cells

~1 μM

24 hours

All cells including HeLa cells are cultured in 10% FCS in RPMI 1640 in 5% CO₂. We assessed 48-hour growth inhibition by serial dilution of SB 743921 relative to DMSO-treated cells in 96-well microtiter plates, using 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium. Cell growth is represented as the ratio of absorbance of treated cells to DMSO control, plotted by concentration and fitted to a four-parameter curve. Concentrations at which cellular growth is inhibited by 50% are extrapolated from the curve fit. The DNA content of HeLa cells cultured in the presence or absence of 1 μM SB 743921 for 24 hours is assessed by propidium iodide staining and flow cytometry. Immunofluorescence images are collected of HeLa cells treated for 24 hours with 1 μM SB 743921, fixed with 2% formaldehyde, permeabilized, and stained with DM1-α, anti-γ-tubulin, and 1 μg/mL 4′,6-diamidino-2-phenylindole, and with Alexa 488 secondary goat antirabbit IgG and Rhodamine-X goat antimouse IgG. Images are collected with a DeltaVision Restoration Microscopy System at a magnification of ×600. Z stacks (0.2 μm) are collected, and out of focus information is removed by constrained iterative deconvolution. Z stacks are then compressed into to a single image plane.

Female BDF1 mice with P388 lymphocytic leukemia cells

7.5 mg/kg- 30 mg/kg

Administered via i.p.