Raltegravir

Per i saggi quantitativi di trasferimento di filamento, il substrato di DNA donatore è formato dall'annealing di oligonucleotidi di grado HPLC 5′-GACTCACTATAGGGCACGCGTCAAAATTCCATGACA e 5′-ATTGTCATG GAATTTTGACGCGTGCCCTATAGTGAGTC. Le reazioni (40 μL) contengono 0,75 μM di PFV IN, 0,75 μM di DNA donatore, 4 nM (300 ng) di DNA target pGEM9-Zf(−) superavvolto, 125 mM di NaCl, 5 mM di MgSO₄, 4 μM di ZnCl₂, 10 mM di DTT, 0,8% (vol/vol) di DMSO e 25 mM di BisTris propano–HCl, pH 7,45. Raltegravir è aggiunto alle concentrazioni indicate. Le reazioni sono avviate con l'aggiunta di 2 μL di PFV IN diluita in 150 mM di NaCl, 2 mM di DTT e 10 mM di Tris-HCl, pH 7,4, e interrotte dopo 1 ora a 37 °C con l'aggiunta di 25 mM di EDTA e 0,5% (p/v) di SDS. I prodotti di reazione, deproteinizzati per digestione con 20 μg di proteinasi K per 30 minuti a 37 °C seguita da precipitazione con etanolo, sono separati in gel di agarosio all'1,5% e visualizzati mediante colorazione con bromuro di etidio. I prodotti di integrazione sono quantificati mediante PCR quantitativa in tempo reale, utilizzando Platinum SYBR Green qPCR SuperMix e tre primer: 5′-CTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAAC, 5′-TTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAAC e 5′-GACTCACTATAGGGCACGCGT. Le reazioni di PCR (20 μL) contenevano 0,5 μM di ciascun primer e 1 μL di prodotto di reazione di integrazione diluito. Dopo un passo di denaturazione di 5 minuti a 95 °C, vengono eseguiti 35 cicli in uno strumento PCR CFX96, utilizzando 10 secondi di denaturazione a 95 °C, 30 secondi di annealing a 56 °C e 1 minuto di estensione a 68 °C. Le curve standard sono generate utilizzando diluizioni seriali della reazione di PFV IN WT in assenza di questo composto.

Human MT-4 cells

0.0001-1 μM

5 days

Human MT-4 cells are infected for 2 hours with the SIVmac251, HIV-1 (IIIB) and HIV-2 (CDC 77618) stocks at a multiplicity of infection of, approximately, 0.1. Cells are then washed three times in phosphate buffered saline, and suspended at 5 × 10⁵/mL in fresh culture medium (to primary cells 50 units/mL of IL-2 are added) in 96-well plates, in the presence or absence of a range of triplicate raltegravir concentrations (0.0001 μM -1 μM). Untreated infected and mock-infected controls are prepared too, in order to allow comparison of the data derived from the different treatments. Viral cytopathogeniciy in MT-4 cells is quantitated by the methyl tetrazolium (MTT) method (MT-4/MTT assay) when extensive cell death in control virus-infected cell cultures is detectable microscopically as lack of capacity to re-cluster. The capability of MT-4 cells to form clusters after infection. Briefly, clusters are disrupted by pipetting; and, after 2 hours of incubation at 37 °C, the formation of new clusters is assessed by light microscopy (100 × magnification). Cell culture supernatants are collected for HIV-1 p24 and HIV-2/SIVmac251 p27 core antigen measurement by ELISA. In CEMx174-infected cell cultures, which show a propensity to form syncytia induced by the virus envelope glycoproteins, syncytia are counted, in blinded fashion, by light microscopy for each well at 5 days following infection.

Indian Rhesus macaques

50 mg/kg or 100 mg/kg

Oral administration