Pemetrexed Disodium (LY231514)

L'attività della TS viene saggiata utilizzando un metodo spettrofotometrico, che comporta il monitoraggio dell'aumento di assorbanza a 340 nm risultante dalla formazione del prodotto, 7,8-diidrofolato. Il tampone del saggio contiene 50 mM di acido N-tris[idrossimetil]metil-2-amminoetansolfonico, 25 mM di MgC1₂, 6,5 mM di formaldeide, 1 mM di EDTA e 75 mM di 2-mercaptoetanolo, pH 7,4. Le concentrazioni di desossiuridilato monofosfato, 6R-MTHF e hIS sono rispettivamente 100 μM, 30 μM e 30 nM (1,7 milliunità/mL). Alla concentrazione di 6R-MTHF, vengono saggiate una reazione non inibita e sei concentrazioni di inibitore. I valori di K_{i app} vengono determinati adattando i dati all'equazione di Morrison utilizzando l'analisi di regressione non lineare con l'ausilio del programma ENZFITTER. I valori di K_i vengono calcolati utilizzando l'equazione: K_{i app}= K_i(1 + [S]/K_m), dove [S] è uguale a 30 μM e K_m è uguale a 3 μM. L'attività della DHFR viene saggiata spettrofotometricamente monitorando la scomparsa dei substrati NADPH e 7,8-diidrofolato a 340 nm. La reazione avviene a 25°C in 0,5 mL di tampone fosfato di potassio 50 mM, che contiene 150 mM di KC1 e 10 nM di 2-mercaptoetanolo, pH 7,5, e 14 nM (0,34 milliunità/mL) di DHFR. La concentrazione di NADPH è 10 μM e il 7,8-diidrofolato viene variato a 5, 10 o 15 μM. A ogni concentrazione di 7,8-diidrofolato, vengono saggiate una reazione non inibita e sette concentrazioni di inibitore. Il programma di microcomputer ENZFITI'ER viene utilizzato per ottenere i valori di K_{i app} adattando i dati all'equazione di Morrison mediante analisi di regressione non lineare. K_{i app}= K_i(1 + [S]/K_m), dove [S] è uguale alla concentrazione di 7,8-diidrofolato utilizzata e K_m di 7,8-diidrofolato è uguale a 0,15 μM. L'attività della GARFT viene saggiata spettrofotometricamente monitorando l'aumento dell'assorbanza risultante dalla formazione del prodotto 5,8-dideazafolato a 295 nm. Il solvente di reazione contiene 75 mM di HEPES, 20% di glicerolo e 50 mM di α-tioglicerolo, pH 7,5, a 25°C. Le concentrazioni dei substrati e dell'enzima utilizzati sono 10 μM di α,β-glicinamide ribonucleotide, 0-10 μM di acido 10-formil-5,8-dideazafolico e 10 nM (1,9 milliunità/mL) di GARFT. I valori di K_i vengono calcolati utilizzando il programma Enzyme Mechanism dello spettrofotometro Beckman DU640, che utilizza l'analisi di regressione non lineare per adattare i dati all'equazione di Michaelis-Menten per l'inibizione competitiva.

CCRF-CEM leukemia, GC3/C1 colon carcinoma, and HCT-8 ileocecal carcinoma cells.

0-30 μM

72 hours

Dose-response curves are generated to determine the concentration required for 50% inhibition of growth (IC50). Pemetrexed disodium is dissolved initially in DMSO at a concentration of 4 mg/mL and further diluted with cell culture medium to the desired concentration. CCRF-CEM leukemia cells in complete medium are added to 24-well Cluster plates in a total volume of 2.0 mL. This compound at various concentrations are added to duplicate wells so that the final volume of DMSO is 0.5%. The plates are incubated for 72 hour at 37 °C in an atmosphere of 5% CO₂ in air. At the end of the incubation, cell numbers are determined on a ZBI Coulter counter. For several studies, IC50s are determined for each compound in the presence of either 300 μM AICA, 5 μM thymidine, 100 μM hypoxanthine, or combination of 5 μM hymidine plus 100 μM hypoxanthine. For adherent tumor cells, a modification of the original MTT colorimetric assay is used to measure cell cytotoxicity. The human tumor cells are seeded in 100 μL assay medium/well in 96-well flat-bottomed tissue culture plates. The assay medium contains folic acid-free RPMI 1640 supplemented with 10% FCS and either 2 nM folinic acid or 2.3 μM folic acid as the sole folate source. Well 1A is left blank. Stock solutions of antifolates are prepared in Dulbecco's PBS at 1 mg/mL, and a series of 2-fold dilutions are subsequently made in PBS. Ten-μL aliquots of each concentration are added to triplicate wells. Plates are incubated for 72 hours at 37 °C in a humidified atmosphere of 5% CO₂-in-air. MTT is dissolved in PBS at 5 mg/mL, 10 μL of stock MTF solution are added to each well of an assay, and the plates are incubated at 37 °C for 2 additional hours. Following incubation, 100 μL of DMSO are added to each well. After thorough formazan solubilization, the plates are read on a Dynatech MR600 reader, using a test wavelength of 570 nm and a reference wavelength of 630 nm. The IC50 is determined as the concentration of drug required to inhibit cell growth by 50% compared to an untreated controls.

EMT-6 mammary carcinoma, the human HCT 116 colon carcinoma, and the human H460 non-small cell lung carcinoma are injected s.c. into the nude mice.

100 mg/kg or 150 mg/kg

Administered via i.p.