Palomid 529 (P529)

Palomid 529 (P529) inibisce la proliferazione e aumenta l'apoptosi delle cellule endoteliali, inibendo la proliferazione delle cellule endoteliali sia VEGF-driven che bFGF-driven con IC50 di 20 nM e 30 nM, rispettivamente. Mantiene la capacità di indurre l'apoptosi delle cellule endoteliali e diminuisce la fosforilazione di pAktS473, pGSK3βS9 e pS6 indotta da VEGF-A. Tuttavia, questo composto non previene né la chinasi proteica attivata da mitogeni fosforilata (pMAPK) né pAktT308 in modo altrettanto potente di pAktS473.[1] Non solo riduce la risposta proliferativa nella retina ischemica, ma migliora anche l'organizzazione e la struttura dei vasi che si formano. [1] P529 mostra una potente attività antiproliferativa nel panel di linee cellulari NCI-60, con una crescita inibitoria del 50 (GI50) <35 μM. Inoltre, aumenta significativamente l'effetto antiproliferativo della radiazione nelle cellule di cancro alla prostata (PC-3), dando luogo a un'inibizione della crescita concentrazione-dipendente sulle cellule PC-3. Dosi di 2 e 7 μM hanno portato rispettivamente a un'inibizione della crescita del 30 e 60%. Inibisce l'attivazione di p-Akt indotta dalla radiazione e diminuisce il rapporto Bcl-2/Bax in PC-3. Questo composto non solo inibisce la sovraespressione di Id-1 e VEGF indotta dalla radiazione, ma regola anche negativamente MMP-2 e MMP-9 indotte dalla radiazione. [2]

Palomid 529 (P529) mostra un'inibizione dose-dipendente dell'angiogenesi indotta da Ad-VEGF-A a seguito del suo trattamento. Inibisce la crescita del tumore del glioma C6V10 in topi nudi dopo dosaggio i.p. e diminuisce la segnalazione di AktS473 ma non AktT308. Questo composto inibisce anche la crescita tumorale, l'angiogenesi e la permeabilità vascolare. [1] Il trattamento di topi portatori di tumore PC-3 con esso ha ridotto la crescita tumorale al 57,1% rispetto ai controlli. [2] È un efficace soppressore della proliferazione delle cellule di Müller, della formazione di cicatrici gliali e della morte delle cellule fotorecettrici in un modello di distacco di retina (RD) di coniglio. [3] Palomid 529 sopprime significativamente la crescita del tumore con deficit di Brca1 nei topi attraverso l'inibizione della segnalazione sia di Akt che di mTOR. [4]

• Saggi di legame al recettore degli estrogeni

  Le proteine sono prodotte con lisati di reticolociti di coniglio. La quantità di stampo utilizzata in ogni reazione è determinata empiricamente e l'espressione è monitorata in reazioni parallele in cui la [³⁵S]metionina è incorporata nel recettore, seguita da elettroforesi su gel ed esposizione a pellicola. Le reazioni di legame dei recettori degli estrogeni (ER) e Palomid 529 (P529) vengono eseguite in volumi finali di 100 μL in tampone TEG [10 mM Tris (pH 7.5), 1.5 mM EDTA, 10% glicerolo]. Il recettore trascritto-tradotto in vitro (5 μL) viene utilizzato in ogni reazione di legame in presenza di 0,5 nM di [³H]estradiolo (E2). Questo composto viene testato routinariamente da 10^-11 a 10^-6 M e diluito in etanolo. Le reazioni vengono incubate a 4 °C durante la notte e l'E2 legato viene quantificato aggiungendo 200 μL di carbone rivestito di destrano. Dopo una rotazione di 15 minuti a 4 °C, le provette vengono centrifugate per 10 minuti e 150 μL del surnatante vengono aggiunti a 5 mL di miscela di scintillazione per la determinazione dei cpm mediante conteggio a scintillazione liquida. Il legame massimo viene determinato competendo l'E2 legato con solo il veicolo di etanolo. Controlli per il background sono inclusi in ogni esperimento utilizzando 5 μL di lisato di reticolociti di coniglio non programmato. Questo valore, tipicamente dal 10% al 15% dei conteggi massimi, viene sottratto da tutti i valori. I dati vengono rappresentati graficamente e vengono calcolati i valori di K_i. Gli esperimenti vengono condotti almeno tre volte in duplicato.

• Linee cellulari

  Human umbilical vascular endothelial cells (HUVEC)

• Concentrazioni

  ~20 μM

• Tempo di incubazione

  48 hours

• Metodo

  Human umbilical vascular endothelial cells (HUVEC) are used. The proliferation assay is carried out by seeding the HUVECs in 96-well plates at a density of 1,000 per well in complete medium. Following a 24-hour plating period, the cells are starved for 24 hours in 0.5% serum before being treated with Palomid 529 (P529) in the presence of 10 ng/mL basic fibroblast growth factor (bFGF) or VEGF in complete medium. After 48 hours, cell number is determined using a colorimetric method. The results are expressed as the percentage of the maximal bFGF or VEGF response in the absence of this compound. Nonproliferating endothelial cells are assayed by growing HUVECs to quiescence in 96-well plates and treating with it for 48 hours. Initially, 5,000 cells per well are seeded and confluence is achieved the next day. The plates are incubated for another 24 hours to ensure growth arrest before treatment with the same compound.