PF-02341066 (Crizotinib)

PF-2341066 mostra una potenza simile contro la fosforilazione di c-Met in cellule epiteliali di topo mIMCD3 o di cane MDCK con IC50 di 5 nM e 20 nM, rispettivamente. Questo composto mostra un'attività migliorata o simile contro le cellule NIH3T3 ingegnerizzate per esprimere i mutanti del sito di legame dell'ATP di c-Met V1092I o H1094R o il mutante del P-loop M1250T con IC50 di 19 nM, 2 nM e 15 nM, rispettivamente, rispetto alle cellule NIH3T3 che esprimono il recettore wild-type con IC50 di 13 nM. Al contrario, un marcato spostamento nella potenza di questo composto è osservato contro le cellule ingegnerizzate per esprimere i mutanti del loop di attivazione di c-Met Y1230C e Y1235D con IC50 di 127 nM e 92 nM, rispettivamente, rispetto al recettore wild-type. Previene inoltre potentemente la fosforilazione di c-Met nelle cellule NCI-H69 e HOP92, con IC50 di 13 nM e 16 nM, rispettivamente, che esprimono le varianti endogene di c-Met R988C e T1010I, rispettivamente. Questo composto è >1.000 volte selettivo per i RTK VEGFR2 e PDGFRβ, >250 volte selettivo per IRK e Lck, e ~40-60 volte selettivo per Tie2, TrkA e TrkB, tutti rispetto a c-Met. È 20-30 volte selettivo per i RTK RON e Axl. Al contrario, questo composto mostra un IC50 quasi equivalente di 24 nM contro la variante di fusione oncogenica nucleofosmina (NPM)-chinasi del linfoma anaplastico (ALK) del RTK ALK espressa dalla linea cellulare di linfoma anaplastico a grandi cellule umane (ALCL) KARPAS299. Inibisce i fenotipi neoplastici c-Met-dipendenti delle cellule tumorali e i fenotipi angiogenici delle cellule endoteliali. Questa sostanza chimica sopprime la crescita delle cellule di carcinoma gastrico umano GTL-16 con un IC50 di 9,7 nM. Induce l'apoptosi nelle cellule GTL-16 con un IC50 di 8,4 nM. Inibisce la migrazione e l'invasione delle cellule di carcinoma polmonare umano NCI-H441 stimolate da HGF con IC50 di 11 nM e 6,1 nM, rispettivamente. Inibisce la dispersione delle cellule MDCK con un IC50 di 16 nM. Previene la fosforilazione di c-Met stimolata da HGF, la sopravvivenza cellulare e l'invasione del Matrigel con IC50 di 11 nM, 14 nM e 35 nM, rispettivamente. Inoltre, previene la tubulogenesi di ramificazione delle HMVEC stimolata dal siero (formazione di tubi vascolari) in gel di fibrina. [1] Inibisce inoltre potentemente la fosforilazione di NPM-ALK nelle cellule ALCL Karpas299 o SU-DHL-1 con un IC50 di 24 nM. Questo composto previene potentemente la proliferazione cellulare, che è associata all'arresto del ciclo cellulare in fase G(1)-S e all'induzione dell'apoptosi nelle cellule ALCL ALK-positive con IC50 di 30 nM, ma non nelle cellule di linfoma ALK-negative. [2] Inoltre, previene il comportamento dell'osteosarcoma associato alla crescita tumorale primaria (cioè, proliferazione e sopravvivenza) così come alla metastasi (es. invasione e clonogenicità). [3]

Nel modello GTL-16, PF-2341066 rivela la capacità di causare una marcata regressione di grandi tumori stabiliti (>600 mm³) sia nelle coorti di trattamento da 50 mg/kg/giorno che da 75 mg/kg/giorno, con una diminuzione del 60% del volume tumorale medio nel corso del programma di somministrazione di 43 giorni. In un altro studio, questo composto mostra la capacità di inibire completamente la crescita tumorale GTL-16 per >3 mesi, con solo 1 topo su 12 che mostra un aumento significativo della crescita tumorale nel corso del programma di trattamento di 3 mesi a 50 mg/kg/giorno. Nel modello NSCLC NCI-H441, si osserva una diminuzione del 43% del volume tumorale medio a 50 mg/kg/giorno durante il ciclo di somministrazione di PF-2341066 di 38 giorni. Nel modello RCC Caki-1, si osserva una diminuzione del 53% del volume tumorale medio associata a una diminuzione del volume di ciascun tumore di almeno il 30% a 50 mg/kg/giorno durante il ciclo di somministrazione di PF-2341066 di 33 giorni. Questo composto rivela anche una prevenzione quasi completa della crescita di tumori stabiliti a 50 mg/kg/giorno nei modelli di xenotrapianto di glioblastoma U87MG o carcinoma prostatico PC-3, con un'inibizione del 97% o 84% nell'ultimo giorno dello studio, rispettivamente. Al contrario, questa sostanza chimica somministrata per via orale a 50 mg/kg/giorno non inibisce significativamente la crescita tumorale nel modello di carcinoma mammario MDA-MB-231 o nel modello di carcinoma del colon DLD-1. Si osserva una significativa riduzione dose-dipendente delle cellule endoteliali CD31-positive a 12,5 mg/kg/giorno, 25 mg/kg/giorno e 50 mg/kg/giorno nei tumori GTL-16, indicando che l'inibizione della MVD mostra una correlazione dose-dipendente con l'efficacia antitumorale. Questo composto mostra una significativa riduzione dose-dipendente dei livelli plasmatici umani di VEGFA e IL-8 in entrambi i modelli GTL-16 e U87MG. Una marcata inibizione dei livelli di c-Met, Akt, Erk, PLCλ1 e STAT5 fosforilati è osservata nei tumori GTL-16 dopo somministrazione orale di questo composto.[1] La somministrazione orale di questa sostanza chimica a topi SCID-Beige portatori di xenotrapianti di tumore ALCL Karpas299 porta a un'efficacia antitumorale dose-dipendente con regressione completa di tutti i tumori alla dose di 100 mg/kg/giorno entro 15 giorni dall'iniziale somministrazione del composto. Inoltre, l'inibizione dei mediatori chiave della segnalazione NPM-ALK, tra cui la fosfolipasi C-gamma, i trasduttori di segnale e gli attivatori della trascrizione 3, le chinasi regolate da segnali extracellulari e Akt da parte di questo composto è osservata a concentrazioni o livelli di dose che correlavano con l'inibizione della fosforilazione e della funzione di NPM-ALK.[2] Questo composto previene il comportamento dell'osteosarcoma associato alla crescita del tumore primario (ad esempio, proliferazione e sopravvivenza) e alla metastasi (ad esempio, invasione e clonogenicità). Nei topi nudi trattati con questa sostanza chimica mediante gavage orale, la crescita e l'osteolisi associata e la formazione della matrice ossea extracorticale degli xenotrapianti di osteosarcoma sono prevenute da questo composto.[3] Il trattamento di xenotrapianti GTL-16 amplificati per c-MET con 50 mg/kg di questo composto induce una regressione tumorale associata a una lenta riduzione dell'assorbimento di ¹⁸F-FDG e a una diminuzione dell'espressione del trasportatore di glucosio 1, GLUT-1.[4]

• Saggi ELISA di fosforilazione di chinasi cellulari

  Le cellule vengono seminate in piastre a 96 pozzetti in terreno supplementato con 10% di siero fetale bovino (FBS) e trasferite in terreno privo di siero [con 0,04% di albumina di siero bovino (BSA)] dopo 24 h. Negli esperimenti che indagano la fosforilazione della RTK dipendente dal ligando, i corrispondenti fattori di crescita vengono aggiunti per un massimo di 20 min. Dopo l'incubazione delle cellule con questo composto per 1 h e/o ligandi appropriati per i tempi designati, le cellule vengono lavate una volta con HBSS supplementato con 1 mM di Na₃VO₄, e i lisati proteici vengono generati dalle cellule. Successivamente, la fosforilazione delle chinasi proteiche selezionate viene valutata mediante un metodo ELISA a sandwich utilizzando anticorpi di cattura specifici usati per rivestire piastre a 96 pozzetti e un anticorpo di rilevamento specifico per i residui di tirosina fosforilati. Le piastre rivestite con anticorpi vengono (a) incubate in presenza di lisati proteici a 4°C per tutta la notte; (b) lavate sette volte in Tween 20 all'1% in PBS; (c) incubate in un anticorpo anti-fosfotirosina totale (PY-20) coniugato con perossidasi di rafano (1:500) per 30 min; (d) lavate nuovamente sette volte; (e) incubate in substrato di perossidasi 3,3′,5,5′-tetrametil benzidina per avviare una reazione colorimetrica che viene interrotta aggiungendo 0,09 N H₂SO₄; e (f) misurate per l'assorbanza a 450 nm utilizzando uno spettrofotometro.

• Linee cellulari

  GTL-16 gastric carcinoma cells and T47D breast carcinoma cells

• Concentrazioni

  0-256 nM

• Tempo di incubazione

  1 hour

• Metodo

  Cells including GTL-16 gastric carcinoma cells and T47D breast carcinoma cells are seeded in 96-well plates in media supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and transferred to serum-free media [with 0.04% bovine serum albumin (BSA)] after 24 hours. In experiments investigating ligand-dependent RTK phosphorylation, corresponding growth factors are added for up to 20 minutes. After incubation of cells with this compound for 1 hour and/or appropriate ligands for the designated times, cells are washed once with HBSS supplemented with 1 mM Na₃VO₄, and protein lysates are generated from cells. Subsequently, phosphorylation of selected protein kinases is assessed by a sandwich ELISA method using specific capture antibodies used to coat 96-well plates and a detection antibody specific for phosphorylated tyrosine residues. Antibody-coated plates are (a) incubated in the presence of protein lysates at 4 °C overnight; (b) washed seven times in 1% Tween 20 in PBS; (c) incubated in a horseradish peroxidase–conjugated anti–total-phosphotyrosine (PY-20) antibody (1:500) for 30 min; (d) washed seven times again; (e) incubated in 3,3^′,5,5^′-tetramethyl benzidine peroxidase substrate to initiate a colorimetric reaction that is stopped by adding 0.09 N H₂SO₄; and (f) measured for absorbance in 450 nm using a spectrophotometer.

• Modelli animali

  Female or male nu/nu mice bearing NCI-H441,or DLD-1, or MDA-MB-231

• Dosaggi

  12.5 mg/kg/day, 25 mg/kg/day, and 50 mg/kg/day

• Somministrazione

  Administered via p.o.