OSI-027

OSI-027 mostra attività di inibizione selettive e competitive dell'ATP contro mTORC1 e mTORC2 con IC50 di 22 nM e 65 nM, rispettivamente. Inoltre, questo composto inibisce la segnalazione di mTOR di fosfo-4E-BP1 con una IC50 di 1 μM in saggi basati su cellule. [1] Esibisce attività antiproliferative contro diverse linee cellulari di leucemia acuta di origine mieloide/megacariocitica in modo dose-dipendente, incluse le cellule U937, KG-1, KBM-3B, ML-1, HL-60 e MEG-01. [2] Uno studio recente mostra che l'inibizione di mTORC1/2 da parte di questa sostanza chimica sopprime efficacemente la fosforilazione di Akt (S473) e la proliferazione cellulare nelle cellule di cancro al seno. [3]

Nel xenotrapianto colorettale GEO, OSI-027 (65 mg/kg) inibisce entrambi gli effettori di mTORC1 e mTORC2, inclusa la fosforilazione di 4E-BP1, Akt e S6. Inoltre, l'inibizione combinata di mTORC1 e mTORC2 da parte di questo composto inibisce potentemente la crescita tumorale più dell'inibizione di mTORC1 da parte della rapamicina. [1]

• Saggi biochimici

  L'inibizione di mTORC1 e mTORC2 viene analizzata utilizzando un complesso enzimatico nativo immunoprecipitato da lisati di HeLa a 1 mM di ATP. Per preparare i lisati cellulari interi dalle cellule HeLa, 25 g di pellet cellulare vengono lisati in 60 mL di tampone A freddo [40 mM HEPES (pH 7,5), 120 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10 mM pirofosfato di sodio, 10 mM glicerofosfato, 50 mM NaF, 0,5 mM ortovanadato e inibitori delle proteasi senza EDTA contenenti 0,3% CHAPS] per 30 minuti su un agitatore magnetico in una stanza fredda. Dopo la chiarificazione dei lisati mediante centrifugazione a 13.000 g per 10 minuti, piastre a 384 pozzetti rivestite con Proteina G vengono incubate con 0,25 μg di anticorpo mTOR in 15 μL di tampone A per 1 ora a 4 °C. A ciascun pozzetto vengono aggiunti 40 μg di lisato di cellule HeLa in 15 μL di tampone A e incubati durante la notte a 4 °C per immunoprecipitare i complessi di mTOR. Le piastre vengono lavate 3 volte con tampone A e due volte con tampone di lavaggio per immunoprecipitazione [Tampone B: 50 mM HEPES (pH 7,5) e 150 mM NaCl]. OSI-027 viene aggiunto a una concentrazione di 10 μM a ciascun pozzetto e il DMSO viene aggiunto ai pozzetti di controllo. La reazione viene avviata aggiungendo 150 ng di 4E-BP1 marcato His come substrato in presenza o assenza di 100 μM di ATP a ciascun pozzetto in 25 μL di tampone chinasi appena preparato [Tampone C: 20 mM HEPES (pH 7,5), 10 mM MgCl₂, 4 mM MnCl₂, 10 mM β-mercaptoetanolo e 200 μM di vanadato] e incubata a temperatura ambiente (TA) per 30 minuti. La reazione viene interrotta trasferendo 25 μL di miscela di reazione da ciascun pozzetto ai pozzetti corrispondenti di nuove piastre rivestite con Ni-chelato e incubata durante la notte a 4 °C seguita da 2 ore a 37 °C. Per rilevare la fosforilazione di 4E-BP1, le piastre vengono lavate una volta con TBST (soluzione salina tamponata con Tris contenente 0,1% Tween-20) contenente 5% di latte scremato in polvere. A ciascun pozzetto vengono aggiunti 25 μL di anticorpi fosfo-4E-BP1 diluiti 1:1.000 in TBST contenente 5% di latte scremato e incubati per 1 ora a TA. Le piastre vengono lavate una volta con TBST e poi vengono aggiunti 25 μL di HRP anti-coniglio (diluito 1:10.000) in TBST contenente 5% di latte scremato. Le piastre vengono incubate per 1 ora a TA e lavate 5 volte con TBST. Per la rilevazione di fosfo-4E-BP1, vengono aggiunti 25 μL di reagenti chemiluminescenti A+B e la chemiluminescenza viene misurata utilizzando un lettore di piastre Analyst.

• Linee cellulari

  U937, KG-1, KBM-3B, ML-1, HL-60, and MEG-01

• Concentrazioni

  0-10 μM

• Tempo di incubazione

  72 hours

• Metodo

  Inhibition of proliferation is measured using the Cell Titer Glo Assay , as noted in figure legends. To generate dose–response curves, cell lines are seeded at a density of 5,000 cells per well in a 96-well plate. After 24 hours of plating, cells are dosed with varying concentrations of either OSI-027 or this compound. The signal for Cell Titer Glo Assay is determined 72 hours after dosing and normalized to that of vehicle-treated controls. Inhibition of proliferation, relative to vehicle-treated controls, is expressed as a fraction of 1 and graphed using PRISM software.

• Modelli animali

  GEO colorectal cells are injected s.c. into the right flank of nu/nu CD-1 mice.

• Dosaggi

  ≤65 mg/kg

• Somministrazione

  Administered via gavage.