KU-0063794

Rispetto all'inibitore di mTOR PP242, KU-0063794 mostra una maggiore specificità per mTOR, essendo inattivo contro PI3K o altre 76 chinasi. Nelle cellule HEK-293, questo composto a 30 nM è sufficiente per ablare rapidamente l'attività di S6K1 bloccando la fosforilazione del motivo idrofobico (Thr³⁸⁹) e successivamente la fosforilazione del residuo del T-loop (Thr²²⁹). In caso di stimolazione con IGF1 di cellule HEK-293 private di siero, sono necessari 300 nM di questo composto per inibire l'attività di S6K1 di circa il 90%. Questa sostanza chimica a 100-300 nM inibisce anche completamente la fosforilazione indotta da aminoacidi di S6K1 e della proteina S6. Similmente a S6K1, inibisce la fosforilazione di mTORC1 a Ser²⁴⁴⁸ e di mTORC2 a Ser²⁴⁸¹ in modo dose-dipendente e tempo-dipendente. In presenza di siero o a seguito di stimolazione con IGF1, questo composto induce un'inibizione dose-dipendente dell'attività e della fosforilazione di Akt a Ser⁴⁷³ e dell'inattesa Thr³⁰⁸, nonché la fosforilazione dei substrati di Akt PRAS40 a Thr²⁴⁶, GSK3α/GSK3β a Ser²¹/Ser⁹ e Foxo-1/3a a Thr²⁴/Thr³². Questo composto, ma non la rapamicina, inibisce l'attività di SGK1 e la fosforilazione di Ser⁴²², così come il suo substrato fisiologico NDGR1 in modo dose-dipendente, nella stessa misura della fosforilazione di S6K1 e Akt, mentre non inibisce la fosforilazione di ERK o RSK indotta da estere di forbolo e l'attivazione di RSK. Rispetto alla rapamicina, questo composto chimico mostra una potenza più significativa nell'indurre la completa defosforilazione di 4E-BP1 a Thr³⁷, Thr⁴⁶ e Ser⁶⁵. Inibisce la crescita cellulare sia dei MEF wild-type che di quelli deficienti in mLST8 e induce un arresto del ciclo cellulare in fase G1, in modo più significativo rispetto alla rapamicina. [1]

Ku0063794 inibisce la crescita tumorale e la segnalazione mTOR in un modello preclinico di carcinoma a cellule renali. Tuttavia, questo composto non è stato più efficace nello studio animale. Una possibile spiegazione per la mancanza di maggiore attività in vivo per questa sostanza chimica[2].

• Saggi chinasici dei complessi di mTOR

  Le cellule HEK-293 vengono lisate fresche in tampone di lisi Hepes. Il lisato (1-4 mg) viene pre-chiarificato incubando con 5-20 μL di Proteina G-Sepharose coniugata a IgG pre-immune. Gli estratti del lisato vengono quindi incubati con 5-20 μL di Proteina G-Sepharose coniugata a 5-20 μg di anticorpo anti-Rictor o anti-Raptor, o IgG pre-immune. Tutti gli anticorpi sono coniugati covalentemente a Proteina G-Sepharose. Le immunoprecipitazioni vengono eseguite per 1 ora a 4 °C su una piattaforma vibrante. Gli immunoprecipitati vengono lavati quattro volte con tampone di lisi Hepes, seguiti da due lavaggi con tampone chinasico Hepes. Per gli immunoprecipitati di Raptor utilizzati per fosforilare S6K1, per i due passaggi di lavaggio iniziali il tampone include 0.5 M NaCl per garantire un'attività chinasica ottimale. GST-Akt1 è isolata da cellule HEK-293 private di siero incubate con PI-103 (1 μM per 1 ora). GST-S6K1 è purificata da cellule HEK-293 private di siero incubate con rapamicina (0.1 μM per 1 ora). Le reazioni di mTOR vengono avviate aggiungendo 0.1 mM ATP e 10 mM MgCl₂ in presenza di varie concentrazioni di KU-0063794 e GST-Akt1 (0.5 μg) o GST-S6K1 (0.5 μg). Le reazioni vengono eseguite per 30 minuti a 30 °C su una piattaforma vibrante e interrotte con l'aggiunta di tampone SDS per campioni. Le miscele di reazione vengono quindi filtrate attraverso un filtro Spin-X con pori da 0.22 μm e i campioni vengono sottoposti a elettroforesi e analisi di immunoblotting con gli anticorpi indicati.

• Linee cellulari

  Wild-type and mLST8 deficient MEFs

• Concentrazioni

  Dissolved in DMSO, final concentration ~3 μM

• Tempo di incubazione

  24, 48, and 72 hours

• Metodo

  Cells are treated with KU-0063794 for 24, 48, and 72 hours, and the medium is changed every 24 hours with freshly dissolved this compound. For the measurement of cell growth, cells are washed once with PBS, and fixed in 4% (v/v) paraformaldehyde in PBS for 15 minutes. After washing once with water, the cells are stained with 0.1% Crystal Violet in 10% ethanol for 20 minutes and washed three times with water. Crystal Violet is extracted from cells with 0.5 mL of 10% (v/v) ethanoic (acetic) acid for 20 minutes. The eluate is then diluted 1:10 in water and absorbance at 590 nm is quantified. For the assessment of cell cycle distribution, cells are harvested by trypsinization, washed once in PBS, and re-suspended in ice-cold aq. 70% (v/v) ethanol. Cells are washed twice in PBS plus 1% (w/v) BSA and stained for 20 minutes in PBS plus 0.1% (v/v) Triton X-100 containing 50 g/mL propidium iodide and 50 g/mL RNase A. The DNA content of cells is determined using a FACSCalibur flow cytometer and CellQuest software. Red fluorescence (585 nm) is acquired on a linear scale, and pulse width analysis is used to exclude doublets. Cell-cycle distribution is determined using FlowJo software.

• Modelli animali

  Nu/Nu nude mice

• Dosaggi

  8 mg/kg

• Somministrazione

  i.p.