Ispinesib (SB-715992)

Ispinesib (SB-715992) è un potente inibitore allosterico, reversibile e specifico di KSP, che modifica la proprietà di legame di KSP ai microtubuli e ne disturba il movimento inibendo il rilascio di ADP senza alterare il rilascio del complesso KSP-ADP dal microtubulo. [1] Questo composto mostra una potente attività citotossica in un panel di linee cellulari tumorali, tra cui Colo205, Colo201, HT-29, M5076, Madison-109 e MX-1, con IC50 da 1,2 nM a 9,5 nM. [2] Nelle cellule di carcinoma prostatico PC-3, esso (15 nM e 30 nM) blocca la proliferazione cellulare e induce l'apoptosi regolando i livelli di espressione dei geni che controllano l'apoptosi, la proliferazione cellulare, il ciclo cellulare e la segnalazione cellulare, come EGFR, p27, p15 e IL-11. [3] In un panel di 53 linee cellulari mammarie, Ispinesib (7,4 nM–600 nM) dimostra un'ampia attività inibitoria. Nelle cellule BT-474 e MDA-MB-468, esso (150 nM) induce l'apoptosi, come rivelato da una maggiore proporzione di cellule apoptotiche, un livello più basso di Bcl-X_L antiapoptotico e livelli più alti di Bax e Bid proapoptotici. [4]

Ispinesib (SB-715992) (4,5 mg/kg–15 mg/kg) mostra effetti inibitori contro Colo205, Colo201, HT-29, ma non contro le cellule MX-1, in modelli di xenotrapianto murini. Questo composto (6 mg/kg–10 mg/kg) inibisce anche i tumori solidi murini, tra cui il carcinoma polmonare Madison 109, il sarcoma M5076, così come le leucemie L1210 e P388. [2] In modelli di xenotrapianto murini di cellule di cancro al seno MCF-7, HCC1954, MDA-MB-468 e KPL4, esso (8 mg/kg–10 mg/kg) inibisce la crescita tumorale. [4]

• Analisi Cinetica allo Stato Stazionario dell'Attività ATPasica della KSP Umana e Inibizione da parte di Ispinesib

  L'analisi della specificità della Kinesin viene eseguita utilizzando un sistema di rilevamento piruvato chinasi-lattato deidrogenasi che accoppia la produzione di ADP all'ossidazione del NADH. I cambiamenti di assorbanza sono monitorati a 340 nm. Studi allo stato stazionario che utilizzano concentrazioni nanomolari di KSP vengono eseguiti utilizzando un saggio sensibile basato sulla fluorescenza che impiega un sistema di rilevamento accoppiato piruvato chinasi, piruvato ossidasi e perossidasi di rafano (HRP) che accoppia la generazione di ADP all'ossidazione di Amplex Red a resorufina fluorescente. La generazione di resorufina è monitorata tramite fluorescenza (λ_eccitazione = 520 nm e λ_emissione = 580 nm). Gli esperimenti biochimici allo stato stazionario vengono eseguiti in tampone PEM25 [25 mM Pipes-K⁺ (pH 6,8), 2 mM MgCl₂, 1 mM EGTA] per esperimenti che coinvolgono i microtubuli. L'IC50 per l'inibizione allo stato stazionario è determinata a 500 µM ATP, 5 µM Microtubuli e 1 nM KSP in tampone PEM25. I valori di K_{i app} (costante di dissociazione apparente dell'inibitore) di Ispinesib (SB-715992) vengono estratti dalle curve dose-risposta, con correzione esplicita per la concentrazione enzimatica utilizzando l'equazione di Morrison. La modalità dell'inibitore (ad esempio, competitivo, non competitivo, inibitore acompetitivo o misto) in condizioni di stato stazionario viene determinata misurando l'effetto della sua concentrazione sulla velocità iniziale in funzione delle concentrazioni di substrato. I dati vengono adattati utilizzando equazioni in GraFit alle equazioni di velocità per le varie modalità di inibizione.

• Linee cellulari

  Breast cancer cells, including MCF-7, HCC1954, MDA-MB-468, and KPL4

• Concentrazioni

  0.085 nM–33 µM

• Tempo di incubazione

  72 hours

• Metodo

  After plating cells in log phase of growth in 96-well plates and treating them with Ispinesib (SB-715992) for 72 hours, cell growth is measured using CellTiter-Glo, and luminescence is detected using BioTek FLx800. Data are analyzed and the IC50 value, defined as the drug concentration that results in 50% growth inhibition relative to control, is calculated.

• Modelli animali

  Nude (nu/nu) mice models of MCF7, KPL4, and HCC1954 cells; severe combined immunodeficient (SCID) mice model of MDA-MB-468 cells;

• Dosaggi

  10 mg/kg for nude mice or 8 mg/kg for SCID mice

• Somministrazione

  Intraperitoneal injection on a q4d× schedule (3 doses, every 4 day