Flavopiridol (Alvocidib, HMR-1275)

Per il saggio chinasi CDK1/ciclina B1, le reazioni chinasiche consistono in 100 ng di complesso GST-CDK1/ciclina B1 (umano) espresso da baculovirus, 1 μg di istone HI, 0,2 μCi di [γ-³³P]ATP, 25 μM di ATP in 50 μL di tampone chinasico (50 mM Tris, pH 8.0, 10 mM MgCl₂, 1 mM EGTA, 0.5 mM DTT). Per il saggio chinasi CDK2/ciclina E, le reazioni chinasiche consistono in 5 ng di complesso GST-CDK2/ciclina E (umano) espresso da baculovirus, 0,5 μg di proteina di fusione GST-RB (aminoacidi 776-928 della proteina del retinoblastoma), 0,2 μCi di [γ-³³P]ATP, 25 μM di ATP in 50 μL di tampone chinasico (50 mM Hepes, pH 8.0, 10 mM MgCl₂, 1 mM EGTA, 2 mM DTT). Per il saggio chinasi CDK4/ciclina D1, le reazioni chinasiche consistono in 150 ng di GST-CDK4/ciclina D1 (umano) espresso da baculovirus, 280 ng di Stag-ciclina D1, 0,5 μg di proteina di fusione GST-RB (aminoacidi 776-928 della proteina del retinoblastoma), 0,2 μCi di [γ-³³P]ATP, 25 μM di ATP in 50 μL di tampone chinasico (50 mM Hepes, pH 8.0, 10 mM MgCl₂, 1 mM EGTA, 2 mM DTT). Le reazioni vengono incubate per 45 minuti per CDK1 e CDK2, o 1 ora per CDK4 a 30 °C e interrotte con l'aggiunta di acido tricloroacetico (TCA) freddo a una concentrazione finale del 15%. I precipitati di TCA vengono raccolti su piastre unifilter GF/C utilizzando un raccoglitore universale Filtermate e i filtri vengono quantificati utilizzando un contatore a scintillazione liquida a 96 pozzetti TopCount. Flavopiridol (Alvocidib) viene disciolto a 10 mM in dimetilformamide (DMF) e valutato a sei concentrazioni, ciascuna in triplicato. La concentrazione finale di DMF nel saggio = 2%. I valori di IC50 sono derivati mediante analisi di regressione non lineare e hanno un coefficiente di varianza = 16%. Per saggiare la sua attività su CDK6, viene stabilito un saggio di legame su filtro. Nel miscela di reazione vengono combinati i seguenti: 2 μL di CDK6 (0,7 mg/μL), 5 μL di istone H1 (6 mg/mL), 14 μL di tampone chinasico (60 mM β-glicerofosfato, 30 mM p-nitrofenil fosfato, 25 mM MOPS (pH 7.0), 5 mM EGTA, 15 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 0,1 mM Na-vanadato), 3 μL di concentrazioni crescenti di questo composto diluite in 50% DMSO e 6 μL di ³³P-ATP (1 mCi/mL) in ATP non radioattivo a una concentrazione di 90 μM (concentrazione finale: 15 μM). Il saggio viene avviato con l'aggiunta di ³³P-ATP. La reazione viene incubata per 20 minuti a 30°C. Un'aliquota di 25 μL del surnatante viene quindi spotta su carta di fosfocellulosa Whatman P81. I filtri vengono lavati 5 volte con una soluzione di acido fosforico all'1%. I filtri umidi vengono contati in presenza di 1 mL di fluido scintillatore. L'attività di Cdk9 viene misurata utilizzando 50 nM di Cdk9/ciclina T ricombinante in 50 mM HEPES pH 7.5, 10 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 3 μM Na₃VO₄, 150 μM di peptide CDT di RNA polimerasi e 80 μM di ATP. Il saggio Cdk7 viene eseguito nello stesso tampone utilizzando 37 nM di chinasi purificata in presenza di 200 μM di ATP e 10 μM di proteina legante la mielina come substrato. La potenza di esso verso CDK9 e CDK7 è determinata utilizzando un saggio basato su uno scambiatore anionico forte (resina Dowex 1-X8, forma formiato) o un saggio di scintillazione a prossimità. I valori di IC50 sono calcolati dalle curve dose-risposta.

MCF-7, LNCAP, PC3, HCT116, CACO-2, A549, HL60, K562 cells and et al.

Dissolved in DMSO, final concentrations ~10 μM

72 hours

Cells are exposed to various concentrations of Flavopiridol (Alvocidib) for 72 hours, at which time the tetrazolium dye, MTS in combination with phenazine methosulfate, is added. After 3 hours, the absorbency is measured at 492 nm, which is proportional to the number of viable cells. The results are expressed as IC50 values. For cell cycle analysis, cells are fixed in paraformaldehyde and ethanol, washed, resuspended in a staining solution of TdT enzyme and FITC-dUTP, washed, stained with PI following RNase treatment, and then analyzed by flow cytometry.

Female Balb/c×DBA/2J F1 mice inoculated ip with P388 ascites leukemic cells, and Balb/c nu/nu nude mice subcutaneous implanted with A2780, Br-cycE, or A431 cells

~7.5 mg/kg/day

Injection i.p.