CP-724714

CP-724,714 è marcato selettivamente contro EGFR con IC50 di 6,4 μM. CP-724,714 è >1.000 volte meno potente per IR, IGF-1R, PDGFRβ, VGFR2, abl. Src, c-Met c-jun NH2-terminal kinase (JNK)-2, JNK-3, ZAP-70, chinasi ciclina-dipendente (CDK)-2 e CDK-5. CP-724,714 riduce potentemente l'autofosforilazione indotta da EGF della chimera contenente il dominio chinasico erbB2 con IC50 di 32 nM, ma è marcatamente meno potente contro EGFR nelle cellule NIH3T3 trasfettate. CP-724,714 inibisce sensibilmente la proliferazione delle cellule amplificate erbB2, incluse BT-474 e SKBR3, con IC50 di 0,25 e 0,95 μM. CP-724,714 induce l'accumulo di cellule nella fase G1 e una marcata riduzione nella fase S nelle cellule BT-474 a 1 μM. [1] CP-724,714 esercita probabilmente la sua epatotossicità tramite meccanismi sia di lesione epatocellulare che di colestasi epatobiliare. CP-724,714 mostra inibizione dell'efflusso di colil-lisil e taurocolato (TC) nei canalicoli in epatociti umani criopreservati e coltivati freschi, rispettivamente. CP-724,714 inibisce il trasporto di TC in vescicole di membrana che esprimono la pompa di esportazione dei sali biliari umani con IC50 di 16 μM e inibisce il principale trasportatore di efflusso nei canalicoli biliari, MDR1, con IC50 di ~28 μM. [2]

CP-724,714 (25 mg/kg) viene rapidamente assorbito dopo somministrazione p.o. e causa la riduzione della fosforilazione del recettore erbB2 tumorale dopo la somministrazione in xenotrapianti FRE-erbB2 o BT-474. CP-724,714 induce apoptosi in topi (s.c.) portatori di xenotrapianti FRE-erbB2 e mostra un'inibizione del 50% della crescita tumorale a 50 mg/kg, senza perdita di peso o mortalità. CP-724,714 ha anche una grande attività antitumorale in xenotrapianti MDA-MB-453, MDA-MB-231, LoVo (colon) e Colo-205 (colon). Inoltre, CP-724,714 (30 o 100 mg/kg) riduce la chinasi regolata dal segnale extracellulare e la fosforilazione di Akt in xenotrapianti BT-474. [1]

• Saggi chinasici

  I domini intracellulari ricombinanti di erbB2 (residui amminoacidici 675-1255) ed EGFR (residui amminoacidici 668-1211) sono espressi in cellule Sf9 infettate da baculovirus come proteine di fusione S-transferasi. Le proteine vengono purificate mediante cromatografia di affinità su perle di Sepharose per l'uso nel saggio. Le piastre Nunc MaxiSorp a 96 pozzetti sono rivestite incubando una notte a 37 °C con 100 μL/pozzetto di 0,25 mg/mL di poli(Glu:Tyr, 4:1), PGT in PBS. L'eccesso di PGT viene rimosso per aspirazione e la piastra viene lavata 3 volte con tampone di lavaggio (0,1% Tween 20 in PBS). La reazione chinasica viene eseguita in 50 μL di 50 mM HEPES (pH 7,4) contenente 125 mM di cloruro di sodio, 0,1 mM di ortovanadato di sodio, 1 mM di ATP e ~15 ng di proteina ricombinante. Vengono aggiunti inibitori in DMSO; la concentrazione finale di DMSO è del 2,5%. La fosforilazione viene avviata con l'aggiunta di ATP e prosegue per 6 minuti a temperatura ambiente, con agitazione costante. La reazione chinasica viene terminata aspirando la miscela di reazione e lavando quattro volte con tampone di lavaggio. Il PGT fosforilato viene misurato dopo un'incubazione di 25 minuti con 50 μL/pozzetto di anticorpo anti-fosfotirosina PY54 coniugato con HRP, diluito a 0,2 μg/mL in tampone di blocco (3% BSA, 0,05% Tween 20 in PBS). L'anticorpo viene rimosso per aspirazione e la piastra viene lavata quattro volte con tampone di lavaggio. Il segnale colorimetrico viene sviluppato con l'aggiunta di 50 μL/pozzetto di substrato perossidasi per micropiastre Tetrametilbenzidina e interrotto con l'aggiunta di 50 μL/pozzetto di acido solforico 0,09 M. Il prodotto di fosfotirosina formato viene stimato misurando l'assorbanza a 450 nm. Il segnale per i controlli è tipicamente A0,6–1,2, con essenzialmente nessun background nei pozzetti senza ATP, proteina chinasica o PGT, ed è proporzionale al tempo di incubazione per 6 minuti.

• Linee cellulari

  ZR-75-30, HCC-1419, MDA-MB-175, BT-474, SKBR3, MDA-MB-361, UACC-812, T-47D, MDA-MB-453, MDA-MB-468, CAMA-1, MDA-MB-157, MCF-7, MDA-MB-435, ZR-75-1, BT-20, and MDA-MB-231.

• Concentrazioni

  0.1 nM - 10 μM.

• Tempo di incubazione

  6 to 7 days.

• Metodo

  Cells are seeded in duplicate at 5~10 × 10³ per well in 24-well plates. The day after plating, CP-724,714 is added by titrating over six or more dilutions from 0.1 nM to 10 μM. Control wells without CP-724,714 are seeded as well. Cells are grown for 6 to 7 days, at which time surviving cells are counted. After trypsinization, cells are placed in isotone solution and counted immediately using a Coulter Z2 particle counter. Growth inhibition is calculated [(1− experimental value / control value) × 100] for each concentration. Dose-response curves are repeated at least twice and averaged. IC50 values are calculated using Calcusyn Software.

• Modelli animali

  FRE-erbB2 BT-474, MDA-MB-453, MDA-MB-231, LoVo (colon), and Colo-205 (colon) xenografts are established in athymic female mice (CD-1 nu/nu).

• Dosaggi

  ~100 mg/kg.

• Somministrazione

  Administered via p.o.